瑞替普酶溶栓活性测定方法的比较研究
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摘要：目的评估测定瑞替普酶溶栓生物活性的4种方法。方法分别使用凝块溶解法、平板溶圈法、发色底物法及气泡法4种方法，测定同一批瑞替普酶样品的生物活性。结果4种测活方法的误差分别为10%，3%，3%和6%，表明测定瑞替普酶体外生物活性的4种方法均有可比性。结论平板溶圈法和发色底物法测活的重复性较好，特异性好，灵敏度高，较适合测定瑞替普酶活性的要求。
关键词：瑞替普酶；活性测定；平板溶圈法；发色底物法
中图分类号：R961文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)09-0004-04
重组人组织型纤溶酶原(tissue plasminogen activator，tPA)是治疗急性心肌梗死的首选药物[1]。目前对tPA原型分子进行改造后的产品瑞替普酶(Reteplase)已在欧美上市。此产品只含有tPA 527个氨基酸中的355个(1～3和176～527，简称K2tPA)[2]，与原型tPA相比较，瑞替普酶具有使用剂量小，体内半衰期长，溶栓活性高，临床使用方便(可静脉推注)，出血副作用小等优点，是很有前景的溶血栓药物。我们用基因工程技术制备并获得K2tPA重组蛋白质[3，4]。为研究重组瑞替普酶的体外激活纤溶酶原的生物活性，我们分别用凝块溶解法[5]，平板溶圈法[6]，发色底物法[7]，气泡上升法[8]测定瑞替普酶样品的活性，以期选出重复性和特异性好，灵敏度高的瑞替普酶新药活性检测方法。现将结果报道如下。
1材料与方法
1.1药品与仪器
瑞替普酶(批号20030526，山东元隆生物技术有限公司制备)，使用时用注射用水溶解为1 U/mL，稀释时用专用溶媒。
对照品(德国宝灵曼公司产品，商品名Retevase，10 U/瓶)(U：宝灵曼公司商品的单位，1 U =106 u，u：国际单位)，使用时先用注射用水溶解为106 u/mL，稀释时用专用溶媒。溶媒组成：1 mmol/L PB(pH 6.5)，蔗糖50 mg/mL，Tween-80 0.005%。
发色底物法试剂盒(上海太阳生物技术公司)；ELX800型酶标仪(Biotek)。
1.2方法
1.2.1凝块溶解法从家兔耳外缘静脉抽血10 mL，置入柠檬酸抗凝管4 000 r/min离心15 min，分离血浆。取小试管若干支，每支加入血浆0.2 mL，巴比妥钠缓冲液(pH7.4)0.4 mL，混匀；迅速向每支加入0.025 mol/L CaCl2 0.4 mL，立即混匀并置37 ℃水浴，凝固后取出；加入不同浓度的对照品(10，100，1 000，10 000 u/ mL)及瑞替普酶样品(原样品稀释104倍)20μL，均做平行管；37℃水浴，同时启动秒表计时。待凝块溶解50%时，停止对该管计时。取各平行管的时间均值，与相应浓度作标准曲线。求出瑞替普酶样品平行管的时间均值，在标准曲线上查出相应浓度，乘以稀释倍数(104倍)即得样品浓度。同时用溶媒作空白对照。
1.2.2平板溶圈法称取125 mg琼脂糖，加入23 mL生理盐水溶液，煮沸溶解，60℃水浴平衡；加凝血酶14 mol/L (100 u/mL)，纤溶酶原280μL(0.5 mg/mL)，边加边摇匀；加2.2 mL人纤维蛋白原(6 mg/mL)，不停地摇匀；混浊后立即倒平皿(直径8 cm)，水平放置充分凝固后4℃放置至少30 min待用(应于2 d内使用)。对照品用生理盐水稀释5个稀释度(u/mL)即1 000，250，62.5，15.6，3.9。待检样品根据标示量稀释至大约100 u/mL或lμg/mL的浓度，待用。同时用溶媒作空白对照。在形成的纤维蛋白平皿内打孔(直径2 mm)，每孔点样10 mL，每个待检样品和标准品各点2个孔，37℃湿盒水平放置24 h。纵横2次量取溶圈直径，以各稀释度活性的对数为横坐标(x)，以溶圈直径的平均数(4次量取的数值)的对数为纵坐标(y)，按生物统计学方法分析结果，求得y=a+bx中的a和b及线性回归系数r值，根据待检样品的溶圈直径求得待检样品的活性。
1.2.3发色底物法按试剂盒的说明操作。首先用水将对照品Retevase配制到浓度106u/mL，再用缓冲液稀释2×107倍，此时对照品的活性为5×10-2 u/mL，最后用缓冲液调整为0.01，0.02，0.03，0.04，0.05 u/mL系列浓度，分别吸取100μL加入酶标板的各孔，用缓冲液将待测样品瑞替普酶稀释2×107倍，吸取100μL加到酶标板各孔。用2.1 mL缓冲液将发色底物、共价物、纤溶酶原混合，吸取100μL加入到有对照品和待测样品孔中，37 ℃湿盒中保温3 h，最后在酶标仪上测定各孔A405值。
1.2.4气泡上升法取试管4 支，各加牛纤维蛋白原溶液(巴比妥-氯化钠缓冲液pH 7.8，稀释成可凝蛋白6.67 mg/mL)0.3 mL，置于37 ℃±0.5 ℃水浴，分别加入巴比妥-氯化钠pH 7.8缓冲液0.79，0.069，0.59，0.49 mL，依次加对照品溶液(60 u/mL)0.2，0.3，0.4，0.5 mL，再分别加混合溶液(5.0 u/mL的牛凝血酶溶液与每1 mL1.4酪蛋白单位的牛纤维蛋白溶酶原溶液，等体积混合)0.4 mL，立即摇匀，置于37 ℃±0.5 ℃水浴中(反应系统应在30～40 s内凝结)分别计时。当凝块内小气泡上升到反应系统体积一半时作为反应终点。以对照品浓度的对数为横坐标，以反应终点时间与入水浴时间差值的对数为纵座标，在双对数纸上绘制标准曲线，根据标准曲线求得待检样品活性。同法测定供试品溶液。
2结果
2.1凝块溶解法
检测不同稀释度的Retevase对照品 ......
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