细胞因子诱导的杀伤细胞体外扩增及其生物学特性的研究(2)
1.3实验方法
1.3.1 PBMC的分离(密度梯度离心法)及LAK、CIK细胞的诱导将人外周抗凝血用淋巴细胞分离，吸取白膜层细胞即PBMC，PBS洗涤3遍，加入含10%无热源胎牛血清RPMI1640(1 mmol/L丙酮酸钠、2 mmol/L谷氨酞胺、10 mmol/L Hepes、89 mmol/L NaHC03、50 μmol/L巯基乙醇、0.1 mg/ml链霉素、100 U/ml青霉素培养基)，调整细胞浓度，接种于25 cm2培养瓶中，1.0×107个/(10 ml·瓶)，置于37℃、5% CO2饱和湿度培养箱内静置2 h，可见分为黏附于瓶壁的细胞和非黏附细胞。取非黏附细胞分成2组。LAK组:加入500 U/ml IL-2，每3天换液1次并补加500 U/ml IL-2。CIK组:第1天加入IFN-γ 1 000 U/ml、IL-1β10 U/ml，24 h后加入IL-2 100 U/ml、CD3mAb 50 ng/ml，此后每隔3 d换液1次，并补加IL-2及CD3mAb。
1.3.2LAK、CIK细胞表型的检测在培养1，4，7，10，13，16，19，22 d取培养的细胞，用PBS洗涤两遍，调整细胞浓度为5.0×106个/ml，取100 μl悬液加入流式专用试管中，加入FITC、PE标记的鼠抗人单克隆抗体CD3-FITC、CD4-PE、CD8-FITC、CD3-FITC、CD56-PE，对照为IgG1-FITC、IgG12PE，25℃下避光孵育0.5 h，用PBS液洗涤3遍，洗去多余的抗体。并用同型无关阴性抗体做对照，在流式细胞仪(美国BD公司)上检测分析，至少分析1.0×105个细胞。
1.3.3 LAK、CIK细胞杀伤活性的检测取对数生长期的肺癌细胞A-549作为靶细胞，用RPMI1640培养基稀释成1.0×105个/(100 μl·孔)，接种细胞于96孔培养板中，然后取出培养两组效应细胞，把效应细胞加入靶细胞孔中混合，另设单独靶细胞和效应细胞组，每组设3个复孔，放置培养箱中培养24 h，每孔加入MTT(5 mg/ml)测仪于570 nm处测OD值，按下面公式计算各组LAK的杀伤活性。
1.4统计学处理
数据采用SPSS12.0统计软件包处理，数据以均数±标准差(x±s)表示，多个均数间使用单因素方差分析，两样本均数的比较用t检验，P, 百拇医药(王佳烈 马国强 包利清 刘艳茹)
1.3.1 PBMC的分离(密度梯度离心法)及LAK、CIK细胞的诱导将人外周抗凝血用淋巴细胞分离，吸取白膜层细胞即PBMC，PBS洗涤3遍，加入含10%无热源胎牛血清RPMI1640(1 mmol/L丙酮酸钠、2 mmol/L谷氨酞胺、10 mmol/L Hepes、89 mmol/L NaHC03、50 μmol/L巯基乙醇、0.1 mg/ml链霉素、100 U/ml青霉素培养基)，调整细胞浓度，接种于25 cm2培养瓶中，1.0×107个/(10 ml·瓶)，置于37℃、5% CO2饱和湿度培养箱内静置2 h，可见分为黏附于瓶壁的细胞和非黏附细胞。取非黏附细胞分成2组。LAK组:加入500 U/ml IL-2，每3天换液1次并补加500 U/ml IL-2。CIK组:第1天加入IFN-γ 1 000 U/ml、IL-1β10 U/ml，24 h后加入IL-2 100 U/ml、CD3mAb 50 ng/ml，此后每隔3 d换液1次，并补加IL-2及CD3mAb。
1.3.2LAK、CIK细胞表型的检测在培养1，4，7，10，13，16，19，22 d取培养的细胞，用PBS洗涤两遍，调整细胞浓度为5.0×106个/ml，取100 μl悬液加入流式专用试管中，加入FITC、PE标记的鼠抗人单克隆抗体CD3-FITC、CD4-PE、CD8-FITC、CD3-FITC、CD56-PE，对照为IgG1-FITC、IgG12PE，25℃下避光孵育0.5 h，用PBS液洗涤3遍，洗去多余的抗体。并用同型无关阴性抗体做对照，在流式细胞仪(美国BD公司)上检测分析，至少分析1.0×105个细胞。
1.3.3 LAK、CIK细胞杀伤活性的检测取对数生长期的肺癌细胞A-549作为靶细胞，用RPMI1640培养基稀释成1.0×105个/(100 μl·孔)，接种细胞于96孔培养板中，然后取出培养两组效应细胞，把效应细胞加入靶细胞孔中混合，另设单独靶细胞和效应细胞组，每组设3个复孔，放置培养箱中培养24 h，每孔加入MTT(5 mg/ml)测仪于570 nm处测OD值，按下面公式计算各组LAK的杀伤活性。
1.4统计学处理
数据采用SPSS12.0统计软件包处理，数据以均数±标准差(x±s)表示，多个均数间使用单因素方差分析，两样本均数的比较用t检验，P, 百拇医药(王佳烈 马国强 包利清 刘艳茹)