大容量人天然噬菌体单链抗体库的构建(2)
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1.2.3 scFv基因的拼接将6种VH基因以scFvf和Linker-为引物，分别进行PCR扩增，获得6种VH-Linker基因片断；将5种Vκ基因以Linker+和scFvγ1为引物，分别进行PCR扩增，获得5种Linker-Vκ基因片断；将6种Vλ基因以Linker+和scFvγ2为引物，分别进行PCR扩增，获得6种Linker-Vλ基因片断。PCR反应条件与前面相同。PCR产物均经1.2%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段。将等摩尔的VH-Linker基因片断与Linker-Vκ基因片断(或Linker-Vλ基因片断)混和后，进行PCR连接。反应10个循环后，补加引物scFvf和scFvγ1(或scFvγ2)，再进行第二次PCR扩增，反应条件与前面相同。PCR产物均经1.2%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，得到连接好的scFv基因片断VH-linker-Vκ(或VH-linker-Vλ)。
1.2.4 大肠埃希菌的电转化用SfiⅠ和NotⅠ酶切scFv基因片段，与经同样双酶切的pCANTAB5E载体在T4 DNA连接酶作用下进行连接。连接产物经QIAquick PCR Purification Kit纯化后电转化感受态E. coli TG1细胞。转化产物立即加入至37℃预热的2 ml 2×YTG培养基中，37℃培养1 h。取少部分转化菌经梯度稀释后铺SOBAG琼脂板，测定库容。其余的菌液涂于SOBAG琼脂板，37℃培养24 h。用2×YT培养基收集细菌集落，加30%甘油冻存于-70℃。
1.2.5 重组率测定从抗体库的SOBAG平板上随机挑取17个单菌落，用相应的引物scFvf与scFvγ1或scFvf与scFvγ2进行PCR扩增，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测相应扩增条带，测定抗体库的重组率。
1.2.6 抗体库的超感染从冻存菌中取适量放于10 ml 2×YT-AG培养基中，稀释细胞至OD600为0.2~0.3，在37℃和250 转振荡培养1 h，加入5×1010 pfu的M13K07辅助噬菌体进行超感染，继续振荡培养1 h，在4℃和2 000转/min下离心30 min，弃上清，菌体重悬于2×YT-AK培养基中在250转/min振荡过夜培养。
1.2.7 噬菌体颗粒的沉淀次日在4℃和8 000转/min下离心30 min，收集上清，加入1/6体积的PEG/NaCl溶液沉淀噬菌体 ......
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