药品细菌内毒素检查经验总结
[摘要] 本文总结了笔者从事药品细菌内毒素检查工作的实践经验，包括实验前准备，鲎试剂购买、储存、使用和灵敏度复核，实验过程中应注意的环节，造成结果异常的因素及解决方法。
[关键词] 细菌内毒素检查；凝胶法；经验总结
[中图分类号]R927 [文献标识码]B [文章编号]1673-7210(2008)05(a)-082-02
《中国药典》2005年版二部将细菌内毒素检查法分为凝胶法和光度测定法[1]。因凝胶法具有简单、经济、应用广泛、对干扰不敏感的优点，因此作为《中国药典》的“仲裁”检查方法而广泛用于注射剂药品细菌内毒素的检查[2]。凝胶法是通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。笔者在药品细菌内毒素检查工作中也多采用凝胶法，本文总结了工作中的实践经验，包括实验前准备，鲎试剂购买、储存、使用和灵敏度复核，实验过程中应注意的环节，造成结果异常的因素及解决方法。现报道如下，以资参考：
, http://www.100md.com
1 实验前准备
1.1 实验器具的精选与前处理
宜选用精度高并经校准的微量移液器和移液管。器具必须经除热原处理。玻璃器皿应经洗液浸泡，新鲜纯化水冲净，250℃干烤至少1 h，未经开封可在1周内使用。恒温器温度计应定期检定，并不是未损坏就可无限期使用。恒温器应稳定放置，避免震动。
1.2 实验环境的准备
《中国药典》只规定实验中防止微生物污染，没对环境作具体规定，但在实际检验中，实验室必须洁净，操作人员在实验前应消毒净化工作台面，最好紫外灯灭菌1 h。
1.3 实验材料的准备
应备好细菌内毒素工作标准品、鲎试剂、BET水、旋涡混合器、微量移液管、恒温器、反应试管、试管架、封口胶、计时器、酒精棉、砂轮片。建议在使用新批次的试管或移液管时要重复干扰试验。
, 百拇医药
2 鲎试剂的购买、储存、使用和灵敏度复核
2.1 购买和储存
宜在冬季购买，以避免运输途中受高温影响。BET水、内毒素标准品及鲎试剂均应在2~10℃避光贮藏，在规定效期内使用。
2.2 使用
根据药液越稀释对反应干扰越小的原理， 灵活应用MVD=CL/λ公式 ，可扩大不同灵敏度鲎试剂的使用范围，避免过期浪费 ，一般可用高灵敏度代替低灵敏度的鲎试剂。
2.3灵敏度复核
鲎试剂灵敏度易有变异，不同厂家不同批号的产品灵敏度可能有差异，在生产、运输、储存过程中，易受温度、光线、时间等外界因素的影响，灵敏度可能下降。准确复核灵敏度，还能考察操作方法是否正确和实验条件是否符合规定。每批新的鲎试剂使用前都应复核灵敏度。
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3 实验过程中应注意的环节
3.1 操作员
要穿戴经灭菌的衣、帽、口罩，动作要仔细、敏捷，实验过程中防止微生物污染。
3.2 鲎试剂复溶与加样
轻弹鲎试剂瓶壁并划痕消毒后掰开，防止玻璃屑落入瓶内，按标示量加入BET水复溶，注意避免产生气泡，加样后混匀封口，垂直放入恒温器中，保温和拿取过程中应避免振动。鲎试剂在液态中极不稳定，室温搁置时间太长会影响反应灵敏度，所以加样结束后应尽快放入恒温器中，在反应尚未完成时不应取出试管观察，以免出现假阴性。另外按照生产厂家说明书制备鲎试剂溶液很重要。
3.3 细菌内毒素国家标准品或工作标准品的复溶
为排除干扰，应在供试品管及阴性对照管完成后进行或在另一实验室进行，工作标准品复溶后于2~8℃下保存，可在2周内使用。取标准品1支，轻弹瓶壁并划痕消毒后掰开，精密加入规定量的BET水，严封，置混合器上混合15 min，然后制备所需浓度的内毒素标准溶液，每步稀释均应混合30 s。3.4时间及温度的控制
, 百拇医药
鲎试剂与内毒素形成凝胶的速率，除与内毒素含量有关外，与培养温度、时间也密切相关。鲎试剂与内毒素在25℃时反应速度已经很快，所以应尽量缩短实验时间，操作准确快速是缩短实验时间的关键。实验室温度偏高易产生假阳性，所以应控制在20℃以下。培养温度不得超过38℃，培养时间为1 h。
4 造成结果异常的原因及解决方法
4.1 造成呈假阴性的原因
可能是由于：①内毒素工作标准品存在问题，包括效价标示不准确、已过期或储存不当造成失效、稀释时振荡不充分或稀释错误、阳性对照管内毒素浓度未达到2λ。②鲎试剂存在问题，包括灵敏度标示不准确、过期失效、振荡不当引起气泡使鲎试剂酶蛋白变性或室温过高破坏了鲎试剂。③恒温器温度低于要求或保温时间不够。④氨基酸对鲎试剂有较强抑制作用，所以含氨基酸供试品易出现假阴性现象。
4.2 假阴性的解决方法
, 百拇医药
包括：规范复核内毒素工作标准品效价和鲎试剂灵敏度，正确贮存并在效期内使用；稀释内毒素应精确，保证PC管内加入2λ的内毒素；复溶鲎试剂时应将水沿管壁缓缓加入，在混合器上振荡30 s，切忌激烈振摇引起气泡；确保培养温度和时间正确。
4.3造成假阳性的原因
包括：实验器具可能存在外源性内毒素或污染了微生物；误操作引起内毒素污染；BET水内毒素超标；实验环境的污染；未严格控制操作时间；培养温度不正确等。
4.4假阳性的解决方法
包括：实验器具要按《中国药典》2005年版的规定处理；使用合格 BET水(37℃ 24 h不产生凝集反应的灭菌注射用水)；保证操作正确，控制操作时间；严格控制操作室的洁净度和温度；确保培养温度和时间正确。
以上是笔者在检验工作中的经验总结，希望能和从事此项工作的同行共同探讨。相信随着实验技术的不断改进，细菌内毒素检查将得到更加广泛的应用。
[参考文献]
[1]中华人民共和国药典委员会.中国药典[S].二部.北京：化学工业出版社，2005.附录85.
[2]于娟，徐雪，毕丽华.凝胶法检查细菌内毒素应注意的问题[J].中国医药导报，2007，4(29)：153-154.
(收稿日期：2008-01-23), http://www.100md.com(樊 丽 赵金英)
[关键词] 细菌内毒素检查；凝胶法；经验总结
[中图分类号]R927 [文献标识码]B [文章编号]1673-7210(2008)05(a)-082-02
《中国药典》2005年版二部将细菌内毒素检查法分为凝胶法和光度测定法[1]。因凝胶法具有简单、经济、应用广泛、对干扰不敏感的优点，因此作为《中国药典》的“仲裁”检查方法而广泛用于注射剂药品细菌内毒素的检查[2]。凝胶法是通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。笔者在药品细菌内毒素检查工作中也多采用凝胶法，本文总结了工作中的实践经验，包括实验前准备，鲎试剂购买、储存、使用和灵敏度复核，实验过程中应注意的环节，造成结果异常的因素及解决方法。现报道如下，以资参考：
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1 实验前准备
1.1 实验器具的精选与前处理
宜选用精度高并经校准的微量移液器和移液管。器具必须经除热原处理。玻璃器皿应经洗液浸泡，新鲜纯化水冲净，250℃干烤至少1 h，未经开封可在1周内使用。恒温器温度计应定期检定，并不是未损坏就可无限期使用。恒温器应稳定放置，避免震动。
1.2 实验环境的准备
《中国药典》只规定实验中防止微生物污染，没对环境作具体规定，但在实际检验中，实验室必须洁净，操作人员在实验前应消毒净化工作台面，最好紫外灯灭菌1 h。
1.3 实验材料的准备
应备好细菌内毒素工作标准品、鲎试剂、BET水、旋涡混合器、微量移液管、恒温器、反应试管、试管架、封口胶、计时器、酒精棉、砂轮片。建议在使用新批次的试管或移液管时要重复干扰试验。
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2 鲎试剂的购买、储存、使用和灵敏度复核
2.1 购买和储存
宜在冬季购买，以避免运输途中受高温影响。BET水、内毒素标准品及鲎试剂均应在2~10℃避光贮藏，在规定效期内使用。
2.2 使用
根据药液越稀释对反应干扰越小的原理， 灵活应用MVD=CL/λ公式 ，可扩大不同灵敏度鲎试剂的使用范围，避免过期浪费 ，一般可用高灵敏度代替低灵敏度的鲎试剂。
2.3灵敏度复核
鲎试剂灵敏度易有变异，不同厂家不同批号的产品灵敏度可能有差异，在生产、运输、储存过程中，易受温度、光线、时间等外界因素的影响，灵敏度可能下降。准确复核灵敏度，还能考察操作方法是否正确和实验条件是否符合规定。每批新的鲎试剂使用前都应复核灵敏度。
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3 实验过程中应注意的环节
3.1 操作员
要穿戴经灭菌的衣、帽、口罩，动作要仔细、敏捷，实验过程中防止微生物污染。
3.2 鲎试剂复溶与加样
轻弹鲎试剂瓶壁并划痕消毒后掰开，防止玻璃屑落入瓶内，按标示量加入BET水复溶，注意避免产生气泡，加样后混匀封口，垂直放入恒温器中，保温和拿取过程中应避免振动。鲎试剂在液态中极不稳定，室温搁置时间太长会影响反应灵敏度，所以加样结束后应尽快放入恒温器中，在反应尚未完成时不应取出试管观察，以免出现假阴性。另外按照生产厂家说明书制备鲎试剂溶液很重要。
3.3 细菌内毒素国家标准品或工作标准品的复溶
为排除干扰，应在供试品管及阴性对照管完成后进行或在另一实验室进行，工作标准品复溶后于2~8℃下保存，可在2周内使用。取标准品1支，轻弹瓶壁并划痕消毒后掰开，精密加入规定量的BET水，严封，置混合器上混合15 min，然后制备所需浓度的内毒素标准溶液，每步稀释均应混合30 s。3.4时间及温度的控制
, 百拇医药
鲎试剂与内毒素形成凝胶的速率，除与内毒素含量有关外，与培养温度、时间也密切相关。鲎试剂与内毒素在25℃时反应速度已经很快，所以应尽量缩短实验时间，操作准确快速是缩短实验时间的关键。实验室温度偏高易产生假阳性，所以应控制在20℃以下。培养温度不得超过38℃，培养时间为1 h。
4 造成结果异常的原因及解决方法
4.1 造成呈假阴性的原因
可能是由于：①内毒素工作标准品存在问题，包括效价标示不准确、已过期或储存不当造成失效、稀释时振荡不充分或稀释错误、阳性对照管内毒素浓度未达到2λ。②鲎试剂存在问题，包括灵敏度标示不准确、过期失效、振荡不当引起气泡使鲎试剂酶蛋白变性或室温过高破坏了鲎试剂。③恒温器温度低于要求或保温时间不够。④氨基酸对鲎试剂有较强抑制作用，所以含氨基酸供试品易出现假阴性现象。
4.2 假阴性的解决方法
, 百拇医药
包括：规范复核内毒素工作标准品效价和鲎试剂灵敏度，正确贮存并在效期内使用；稀释内毒素应精确，保证PC管内加入2λ的内毒素；复溶鲎试剂时应将水沿管壁缓缓加入，在混合器上振荡30 s，切忌激烈振摇引起气泡；确保培养温度和时间正确。
4.3造成假阳性的原因
包括：实验器具可能存在外源性内毒素或污染了微生物；误操作引起内毒素污染；BET水内毒素超标；实验环境的污染；未严格控制操作时间；培养温度不正确等。
4.4假阳性的解决方法
包括：实验器具要按《中国药典》2005年版的规定处理；使用合格 BET水(37℃ 24 h不产生凝集反应的灭菌注射用水)；保证操作正确，控制操作时间；严格控制操作室的洁净度和温度；确保培养温度和时间正确。
以上是笔者在检验工作中的经验总结，希望能和从事此项工作的同行共同探讨。相信随着实验技术的不断改进，细菌内毒素检查将得到更加广泛的应用。
[参考文献]
[1]中华人民共和国药典委员会.中国药典[S].二部.北京：化学工业出版社，2005.附录85.
[2]于娟，徐雪，毕丽华.凝胶法检查细菌内毒素应注意的问题[J].中国医药导报，2007，4(29)：153-154.
(收稿日期：2008-01-23), http://www.100md.com(樊 丽 赵金英)