羊膜自噬的形态及其相关基因表达(2)
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1.2.4溶酶示踪红(LysoTracker Red，LTR)溶酶体标记羊膜上皮细胞离心在玻片上，用5 μmol/L LTR(Molecular Probes, Eugenes, OR)染色30 min，37℃。PBS洗，荧光显微镜检查(Nikon Fluophot)。
1.2.5RT-PCR检查beclin-1，apg-5和DAPK基因羊膜组织PBS洗后，消化脱落的上皮细胞用匀浆磨碎，用TRIzol试剂(Invitrogen，USA)提取总RNA，方法如说明书。取1 μg总RNA应用Promega公司反转录系统进行反转录，总量为20 μl。所有标本2.0 μl cDNA分别加上10 pmol beclin-1，apg-5和DAPK引物，PCR反应用ABI-2400 PCR仪(Thermal cycler，Applied Biosystems)完成，用GAPDH基因作内对照。
1.2.6引物设计根据GenBank，beclin-1，apg-5和DAPK序列设计3对引物，beclin-1引物：5’ TGGATCACCCACTCTGTGAG 3’，5’ TTATTGGCCAGAGCATGGAG 3’(GenBank Accession #AF139131)，产物565 bp；apg-5引物：5’TTTGGCTTTGGTTGAAATAAG 3’，5’ TGTCATTTTGCAATCCCATC 3’(GenBank Accession #BC002699)，产物539 bp；DAPK引物：5’ ACCTGCACTCCCTTCAAATC 3’，5’ CAGAGTATCATCGCTTCTGGC 3’(GenBank Accession #X76104)，产物626 bp；GAPDH引物：5’ CCCCTACTGCCTATATCGAC 3’，5’ AATGATACGGGTGCTCTGAG 3’ ......
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