纯中药制剂“卡宁”对肝癌细胞的作用(2)
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参见附件(1672KB，3页)。
1.2.2 体外细胞抑制实验——MTT比色法用含0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA的消化液消化对数生长期的BEL-7402细胞，用含20%胎牛血清的DMEM培养基调成2.5×104/ml的单细胞悬液，96孔细胞培养板中每孔加入100 μl，待细胞贴壁6 h后加入含药血清，终浓度分别为10%及15%。每一浓度设3个复孔，并设对照组。分别培养24、48和72 h后，每孔加入0.5% MTT 20 μl，继续培养4 h，1 000 r/min离心10 min，去上清后每孔加入DMSO 100 μl，结晶溶解后酶标仪570 nm波长处测定吸光度值，并计算抑制率，实验重复3次。
1.2.3 PCR检测bcl-2基因
1.2.3.1 RNA提取以常规方法提取细胞总RNA。
1.2.3.2 PCR引物由上海生工生物工程公司合成，以聚丙烯酰胺凝胶电泳法纯化。根据t(14；18)的断裂点集中在bcl-2基因的2个热点部位，设计2对引物[1]，分别为：主要断裂区(major breakpoint region，MBR)外引物C：5′-CAG CCT TGA AAC ATT GAT GG-3′，次要断裂区(minor cluster region，MCR)外引物D：5′-CGT GCT GGT ACC ACT CCT G-3′，主要断裂区内引物A：5′-TAT GGT GGT TTG ACC TTT AG-3′，次要断裂区内引物B：5′-GGA CCT TCC TTG GTG TGT TG-3′。
由于断裂点位置不同，所扩增的片段长度波动在300～700 bp。
1.2.3.3 半巢式PCR扩增PCR自动循环仪PTC-200为美国MJ公司产品。DNA多聚酶及dNTP系TOYOBO公司产品。反应总体积为50 μl，其中DNA模板0.6 μg，4种dNTP各200 mol/L，10×buffer(50 mmol/L KCl，10 mmol/L Tris-HCl pH8.0，1.5 mmol/L MgCl2，0.1% Tritox-100)5 μl，引物各50 pmol/L，Taq多聚酶2 U。每管反应液表面覆盖30 μl灭菌液体石蜡。采用半巢式PCR扩增，第一轮用C、JH扩增MBR，D、JH扩增MCR形成融合基因。循环参数为92℃ 50 s，58℃ 50 s，72℃1 min，30个循环。取扩增产物2 μl作为DNA模板进行第二轮扩增，引物分别为A、JH扩增MBR，B、JH扩增MCR形成融合基因，参数同前。每一轮扩增前均进行95℃变性8min，扩增完毕后于72℃再延伸10 min。取10 μl PCR产物进行2%琼脂糖凝胶(含溴化乙啶)电泳，Ladder 100(美国Beohringer Mannein公司)作为分子量标记。无DNA作阴性对照，注射用水作空白对照。
1.3 统计学方法
数据以均数±标准差(x±s)表示，计量资料比较采用t检验，计数资料比较采用采用χ2检验，所用数据均由SPSS软件进行统计学处理，P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 细胞形态学观察
含药血清对BEL-7402细胞形态的影响为：空白对照组细胞生长良好，细胞呈圆形，饱满，折光性强，胞质透明，细胞核大，核膜清晰。含药血清培养20 h后可见部分细胞皱缩，胞质折光性差、深暗，培养48 h后皱缩更多，可见大量细胞碎片。
2.2 MTT检测结果
不同浓度含药“卡宁”血清作用24～72 h后的BEL-7402细胞生长抑制率见表1。含药血清可有效抑制BEL-7402细胞的生长增殖，其抑制率随时间的延长和浓度的增加而增大(P<0.05)，15%含药血清72 h的抑制作用最强。
表1 含药血清对BEL-7402 细胞的生长抑制率(x±s，%)
Table 1 Growth inhibitory rate of BEL-7402 cell treated
by pastille serum(x±s，%)
与10%及15%含药血清组比较，＃P<0.05；与10%含药血清组24、48 h比较，△P<0.05；与15%含药血清组24、48 h比较，*P<0.05
2.3 含药中药作用72 h后 BEL-7402细胞bcl-2表达情况
“卡宁”作用前细胞bcl-2阳性率为43.14%，10%含药血清作用72 h后，bcl-2表达降低为20.57%；15%含药血清作用后，bcl-2表达由40.12%降低为7.78%；而5-FU组bcl-2的表达则由45.06%降低为30.67%(表2)。15%含药血清72 h的作用最强(P<0.05)。“卡宁”1、2组bcl-2的活性明显低于对照组(P=0.038)。第二轮PCR产物电泳图见图1。
表2 含药血清作用72 h BEL-7402细胞bcl-2的表达(%)
Table 2 bcl-2 gene expression of BEL-7402 cell
after 72 hours treated by pastille serum (%)
与10%含药血清组0 h比较，△P<0.05；与15%含药血清组0 h比较，*P<0.05；与10%及15%含药血清组72 h比较，＃P<0.05
图1 第二轮PCR产物电泳图
1、2：患者甲治疗前后扩增产物；3、4：患者乙治疗前后扩增产物；5、6：健康对照；M：分子量Marker
箭头所示为阳性片段
3 讨论
肿瘤的产生是由于机体正虚邪实的结果。正气不足主要是气虚和血虚，邪实主要是血瘀、痰凝等，所以，《医宗必读》说：“积之成者，正气不足，而后邪气踞之。”因此针对肿瘤病机正虚邪踞的特点，治疗原则应是扶正祛邪。
基于体外诱导肿瘤细胞凋亡，从中药中筛选新的天然抗癌药和研究中药抗癌的分子机制，对于中药走向世界和实现中药现代化有重要的意义。本课题组实验表明，传统中药甘草体外可有效地选择性诱导几种人肿瘤细胞凋亡，莪术活血化瘀，是具有临床应用价值和良好开发前景的天然细胞凋亡诱导剂。
bcl-2是bcl-2凋亡抑制基因家族中的一员。它能抑制细胞凋亡，使细胞长期存活，促使细胞内某些癌基因活化，产生恶性细胞克隆。分化差、体积大的肝癌细胞中bcl-2基因表达增强。
本实验结果显示，10%含药血清作用24 h后，细胞抑制率为(14.44±3.20)%，并随含药血清浓度的增加而增大，15%含药血清作用24 h后细胞抑制率为(32.56±4.36)%。随着作用时间的延长，抑制作用增强，15%含药血清作用48 h后达(42.67±4.18)%，而5-FU组达(10.78±1.65)%(P<0.05)。癌基因bcl-2表达也有减少的趋势，15%血清作用72 h使bcl-2表达率从40.12%下降到7.78%，而5-FU仍达30.67%，这也许是“卡宁”诱导肝癌细胞凋亡的机制。
原发性肝癌在中国的发病率较高 ......
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