针刺对胃扩张模型大鼠孤束核神经元放电的影响(2)
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1 材料与方法
1.1 实验动物
55只雄性SD大鼠，体重250～300 g，由中国中医科学院实验动物中心提供。
1.2 仪器
脑立体定位仪(日本N. Takahashi)，微电极推进器、操纵器(PF5-1，日本光电)，微电极放大器(MEZ-8301，日本光电)，生物放大器(AB-621G，日本光电)，双线记忆示波器(Vc-10，日本光电)，电子刺激器(SEN-7203，日本光电)，隔离器(SS102J，日本光电)，玻璃微电极拉制仪(Model P-97，美国)，冰冻切片机(CM1850，德国莱卡)，307-6台式牙钻车(307-6，上海)。
1.3 软件
Power-Lab/4s Chart4.2生理数据采集分析系统(澳大利亚)。
1.4 方法
1.4.1 实验分组共分为4组。即：①针刺足三里穴组；②针刺内关穴组；③针刺偏历穴组；④针刺合阳穴组。每组均针刺大鼠右侧肢体穴位。
1.4.2 体表刺激点定位按照中国针灸学会实验针灸研究会1992年制订的《实验动物穴位定位标准》及拟人对照法定位：①“足三里”穴(腓骨小头下约5 mm处)；②“内关”穴(前肢下1/6折点处外侧，桡、尺骨缝中)；③“偏历”穴(前肢下1/4折点处桡骨外侧)；④“合阳”穴(腘窝正中下约3 mm处)。
1.4.3 针刺方法穴位针刺由专人操作，均采用1寸毫针，施以平补平泻捻转手法，捻转角度为360°，频率120次/min。
1.4.4 玻璃微电极制备在P-97玻璃微电极拉制仪上拉制玻璃微电极，尖端直径1 μm左右，测定微电极直流电阻应为10～30 MQ，记录前灌冲2.0%滂胺天蓝溶液(pH 7.7)。
1.4.5 手术准备动物禁食后20 h。在室温条件下，大鼠称重后用10%乌拉坦溶液(Urethane，1.0~1.2 g/kg)腹腔麻醉。大鼠取仰卧位，腹部备皮，于剑突下正中线纵向依次切开皮肤、肌层、腹膜，在距幽门0.5 mm的十二指肠处，避开血管，剪一小孔，置入薄膜囊并推进至胃窦部，气囊经聚乙烯软管引出体外，荷包缝合该小孔切口，缝合腹部肌层、皮肤。关腹后转俯卧位。切开头部皮肤，钝性剥离骨膜，暴露前囟，用牙钻车于前囟后约13.8 mm处，正中线旁开约0.8 mm处凿一小孔，手下有落空感即停止，小孔直径约1.0 mm。随后将大鼠固定在脑立体定位仪上。沿两侧外耳道插入耳棒，上门齿固定于牙托，头部制动。在手术显微镜下小心剥离脑膜。
1.4.6 核团定位及电极插入按照Paxions-Watson大鼠脑图谱(1982)[3]，坐标位置：AP 13.3～14.3 mm； L 0～1.8 mm；H 3.7～5.4 cm，在手术显微镜下插入玻璃微电极至脑表面内，随即以石蜡油覆盖以防止干燥及减少脑波动对微电极位置的影响。在微电极推进器下，以1 μm/s的速度推进玻璃微电极，在3.7～5.4 cm这个深度中遇到放电即立刻停止，使电极尖端停留在放电神经元处，待其放电稳定后开始记录。
1.4.7 胃扩张及针刺实施步骤、记录方法从胃窦引出的聚乙烯软管接注射器针头上，该针头接三通管。三通管另外两端分别接压力换能器和充满自来水的注射器。校对换能器，向气囊内注水10～15 ml，记录胃内压>40 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)所需的注水量后抽回气囊内的水。记录到NTS内稳定的神经元放电后，给与胃扩张刺激，待放电稳定后予体表刺激点针刺。用捻转手法针刺内关穴30 s后同时去除手针及胃扩张刺激，待神经元放电恢复至基线或接近基线水平后再给予下一个处理；依照针刺内关穴的方法针刺足三里、偏历、合阳穴，并同步记录NTS神经元放电。记录完毕，将滂胺天蓝导入所记录细胞(电流强度：3 nA，频率：2 Hz，时间：5 min)。细胞放电的信号经放大器放大，输入给Power-Lab/4 s生理数据采集分析系统，Chart 4.2数据处理软件进行数据处理。
1.4.8 判断标准神经元对刺激的反应有三种情形：兴奋、抑制和无反应，以刺激前后变化频率超过15%作为标准，刺激后频率变化增加15%为兴奋，频率变化减少15%为抑制，这两种统称为有反应神经元，频率变化在15%内为无反应。
1.5 统计学方法
数据以均数±标准差(x±s)表示，神经元对刺激反应的个数为计数资料，神经元放电频率为计量资料。采用SPSS 11.5统计软件进行分析，P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
55只大鼠共记录到149个NTS神经元放电，149个NTS神经元中与胃扩张相关的有65个，其中，44个对胃扩张刺激呈增频反应，21个呈减频反应。65个NTS胃扩张相关神经元中对来自体表刺激有反应的神经元出现比例，针刺足三里、内关、偏历、合阳穴组分别为61.54%、53.85%、29.23%、33.85%。对来自体表的刺激，NTS内胃扩张兴奋神经元主要是兴奋为主。44个对胃扩张刺激呈增频反应的神经元，观察针刺足三里、内关、偏历、合阳穴组前后神经元频率变化，其神经元频率变化率分别为(34.61±6.88)%、(31.73±8.05)%、(19.84±4.50)%、(18.07±4.29)%。统计结果表明，在胃扩张相关神经元中，针刺内关、足三里穴后NTS有反应神经元出现率及兴奋性神经元频率变化率，显著高于针刺偏历、合阳穴组(P<0.01)；针刺内关、足三里穴组之间NTS有反应神经元出现几率及兴奋性神经元频率变化率无显著性差异(P>0.05)(表1、2)。
表1 65个胃扩张相关NTS神经元对其来自体表刺激反应
Table 1 65 NTS gastric distention related neurons responses to body surface stimulation
■有反应神经元个数是指表中胃扩张兴奋性神经元个数中有反应神经元个数(兴奋+抑制)与胃扩张抑制性神经元个数中有反应神经元个数(兴奋+抑制)之和；◆无反应神经元个数是指表中胃扩张兴奋性神经元个数中无反应神经元个数与胃扩张抑制性神经元个数中无反应神经元个数之和。与偏历组比较，*P<0.01；与合阳组比较，ΔP<0.01
表2 NTS胃扩张兴奋性神经元频率变化(x±s)
Table 2 the changes of firing rate for excited NTS neurons induced by gastric distention(x±s) ......
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