喀什0507JS32病毒的分离鉴定(2)
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2 结果
2.1 病毒分离及细胞感染特点
0507JS32是由喀什地区伽师县一户居民家畜圈采集的一组库蚊标本(冻存管编号为M0507JS32)分离的，该病毒对C6/36细胞致病变，而对Vero细胞不致病变，感染C6/36细胞第3天开始出现细胞病变，表现为细胞圆缩、聚集、脱落，病变发展较快，感染C6/36细胞第5天病变可以达到“+++”。
2.2 病毒形态特点
0507JS32病毒负染电镜观察显示，病毒颗粒大小均一，完整病毒颗粒呈球形，无包膜，平均直径55 nm，病毒表面壳粒结构清晰可见(图1)。
2.3 病毒基因组类型
从0507JS32病毒上清中提取RNA，聚丙烯酰胺凝胶电泳显示病毒基因组为12节段dsRNA，上部为较大的6个dsRNA节段，下部为较小的6个dsRNA节段，较小的6个dsRNA节段中第7和8条带、第10和11条带大小相近，不易区分(图2)。
2.4 病毒基因组序列分析
病毒基因组RNA经随机引物逆转录制备cDNA，经外引物LNV12s1/r1和内引物LNV12s2/r2进行巢式PCR扩增，产物1%琼脂糖凝胶电泳结果见图3。核酸序列测定证实该PCR产物长度为435 bp，完全符合预期大小。核酸序列经BLAST比对发现，与LNV-NE9712和LNV-NE9731第12基因片段核酸序列同源性为99.4%和88.9%，提示该病毒为LNV。
3 讨论
LNV病毒最早是在中国东北地区分离的[4]，喀什0507JS32病毒经过病毒形态特点、基因组类型、基因组序列分析鉴定为LNV病毒，说明LNV病毒的分布不仅仅局限于中国东北地区，其他分布还有待进一步研究。喀什0507JS32病毒与当地人畜疾病的关系目前尚不明确，但是该病毒由当地居民家畜圈采集的库蚊分离，提示该病毒与当地人畜接触较为密切，可能是当地人畜共患病的病因。喀什地区疫情监测信息显示，近年来该地区时有不明原因的人畜发热、脑炎散发报道，但是一直缺乏详细的病因学研究。本研究为探索当地可能存在的导致人畜共患病的虫媒病毒提供了一个良好的开端，但是还需要进行进一步的病毒分离和血清流行病学调查工作，以提供更加确切的依据。
dsRNA病毒的基因组核酸电泳带型是此类病毒分类的重要依据，通常不同种类的dsRNA病毒具有不同的基因组带型[5]。本研究中0507JS32病毒的基因组带型与LNV病毒基因组带型相似，已经提示该病毒为LNV病毒。0507JS32病毒基因组序列分析结果进一步证实该病毒为LNV病毒，但是也发现与东北地区分离的LNV病毒存在一定的序列差异，足以说明喀什0507JS32是在当地进化发展而来的另外一株LNV病毒。已知LNV病毒有LNV-NE9712和LNV-NE9731两个型别[6]，0507JS32与LNV-NE9712更加相似，在当地是否存在其他型别的LNV还有待进一步的病毒分离和鉴定工作。
国内已知流行的虫媒病毒病包括乙型脑炎、蜱传脑炎、克里米亚-刚果出血热、登革热，调查地区有克里米亚-刚果出血热流行[7]。20世纪80年代和90年代期间，在霍城、伊利采集的蚊虫标本中分离和鉴定了辛德毕斯病毒[8]、东方马脑炎病毒[9]、西方马脑炎病毒[10]。此次在喀什采集的蚊虫标本中分离和鉴定了LNV病毒，提示全疆虫媒病毒种类远不止现在所知的几种，流行的虫媒病毒病也不仅限于克里米亚-刚果出血热，很可能有其他虫媒病毒导致的人畜共患病流行。因此，在调查地区有必要持续进行虫媒病毒疫情监测和实验室检测，以期及时发现和控制出现的虫媒病毒性疾病流行。
[参考文献]
[1]Karabatsos N. International catalogue of arboviruses including certain other viruses of vertebrates [M]. 3rd ed. San Antonio: American Society of Tropical Medicine and Hygiene,1985.
[2]孙肖红,付士红,王环宇,等.云南省虫媒病毒的分离鉴定[J].中华实验和临床病毒学杂志,2005,19(4):319-325.
[3]Attoui H, Mohd Jaafar F, Belhouchet M, et al. Yunnan orbivirus, a new orbivirus species isolated from Culex tritaeniorhynchus mosquitoes in China [J]. J Gen Virol,2005,86:3409-3417.
[4]陶三菊,蔡增林,杨冬荣,等.从中国东北地区蚊虫标本首次分离到新亚型Colti病毒[J].中华实验和临床病毒学杂志,1999,13(3):228-231 ......
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