糖尿病肾组织TGF-β/Smads信号通路的活化和α-SMA上调表达(2)
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1 材料与方法
1.1 主要试剂
TGF-β多克隆抗体购自Santa Cruz公司，磷酸化Smad2/3多克隆抗体购自New Englang Biolabs公司，α-SMA购自Oncogene公司，LSABR+System、HRP(DAB)和EnVisionTM+System、HRP(DAB)试剂盒为DAKO公司产品。
1.2 实验动物
糖尿病小鼠肾病模型制作方法[7]：2个月龄雄性C57BL/6小鼠36只，体重25～35 g，购自中山大学北校区实验动物中心。所有小鼠随机分成模型组(30只)[腹腔注射STZ 50 mg/(kg·d)，连续5 d]和对照组(6只)(腹腔注射相同体积的枸橼酸缓冲液)，观察16周。以血糖≥16.7 mmol/L为糖尿病诊断标准。实验组于实验第0、4、8、12、16周处死小鼠检查，肾组织以10%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋。
1.3 观察指标及方法
1.3.1 肾组织病变程度分析所有标本按常规方法固定，包埋，切片厚2 μm，HE和Masson染色，光镜观察肾小球、肾小管-间质病理变化。
1.3.2 TGF-β和磷酸化Smad2/3免疫组织化学采用LASB法检测肾组织中TGF-β和磷酸化Smad2/3的表达。取4 μm石蜡切片，常规处理后，滴加预阻断液室温30 min；分别滴加兔抗大鼠TGF-β多克隆抗体(1∶200)和兔抗大鼠磷酸化Smad2/3多克隆抗体，4℃孵育过夜；滴加生物素化抗兔抗体(原液)，37℃孵育45 min，滴加辣根过氧化物酶标记的链酶亲和素(原液)，37℃孵育45 min，最后加DAB-H2O2显色，显微镜下控制显色反应，苏木素复染，中性树胶封片，实验同时采用PBS代替一抗作为阴性对照。TGF-β以肾实质及间质细胞浆内棕褐色颗粒为阳性，磷酸化Smad2/3以肾实质及间质细胞核内棕褐色颗粒为阳性。
1.3.3 肾组织α-SMA免疫组织化学染色采用Envision法检测肾组织α-SMA的表达。取4 μm石蜡切片，常规处理后，滴加山羊血清封闭液室温30 min；滴加小鼠抗大鼠α-SMA(1∶50)单克隆抗体，4℃孵育过夜；滴加辣根过氧化物酶标记的抗小鼠Envision多聚物(原液)，37℃孵育45 min，最后加DAB-H2O2显色，显微镜下控制显色反应，苏木素复染，中性树胶封片，实验同时采用PBS代替一抗作为阴性对照。以肾间质棕褐色颗粒为阳性。
1.4 实验结果的定量
TGF-β和α-SMA半定量分析：应用IBSA 2.5图像分析系统显微镜200倍下随机选取20个视野，按阳性信号所占百分比进行半定量评分后取均值；Smad2/3半定量分析：400倍镜下分别随机选取20个视野，计算每平方毫米肾组织阳性细胞个数后取均值。
1.5 统计学分析
数据以均数±标准差(x±s)表示，用SPSS 11.5统计软件进行分析，均数比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 糖尿病小鼠肾组织TGF-β的表达变化
免疫组织化学染色显示，正常肾组织TGF-β主要位于皮髓交界的肾小管，肾小球基本无表达(图1a)。糖尿病形成后4周，TGF-β的表达明显增加，遍布肾小球和皮、髓质各肾小管，且表达随着肾纤维化的加重明显升高，第12周达高峰(图1b)，第16周表达有所减少，但仍高于对照组(图2)。
图1 糖尿病小鼠不同时点肾组织TGF-β的表达变化
[a：正常小鼠肾组织；b：糖尿病小鼠肾组织(12周)](×200)
图2 不同时点肾组织TGF-β的表达变化
(与对照组比较，*P<0.01)
2.2 糖尿病小鼠肾组织磷酸化Smad2/3的表达和定位
免疫组织化学染色显示，对照组小鼠肾小球和肾小管细胞核内可见少量p-Smad2/3表达(图3a)。随着糖尿病的进展，p-Smad2/3在肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞胞核及局灶浸润细胞核内的表达明显增加，于糖尿病形成后4周显著增加，并持续增加到第12周(图3b)，第16周表达有所减少，但仍高于对照组(图4)。
图3 糖尿病小鼠不同时点肾组织p-Smad2/3的表达与定位
[a：正常小鼠肾组织；b：糖尿病小鼠肾组织(12周)](×200)
图4 不同时点磷酸化Smad2/3的表达变化
(与对照组比较，*P<0.01)
2.3 糖尿病小鼠肾组织α-SMA的表达变化
免疫组织化学染色显示，对照组小鼠α-SMA仅表达于血管平滑肌，肾小球系膜区和肾小管-间质细胞偶有少量表达(图5a)。随着糖尿病的进展，α-SMA除了在血管平滑肌表达外，肾小球系膜区、肾小管间质、萎缩的肾小管周围、肾小管上皮细胞内及局灶细胞浸润处均有α-SMA的表达。于糖尿病形成后4周显著增高，并持续增加到第12周(图5b)，第16周表达有所减少，但仍高于对照组(图6)。
图5 糖尿病小鼠不同时点肾组织α-SMA的表达变化
[a：正常小鼠肾组织；b：糖尿病小鼠肾组织(12周)](×200)
图6 不同时点肾组织α-SMA的表达变化
(与对照组比较，*P<0.01)
2.4 糖尿病小鼠肾组织TGF-β、p-Smad2/3及α-SMA表达之间的关系
糖尿病小鼠肾组织TGF-β、p-Smad2/3及α-SMA表达均明显增加，表达时相一致，肾组织TGF-β的表达与p-Smad2/3显著相关(r1=0.807，P<0.01)；p-Smad2/3与α-SMA亦显著相关(r2=0.804，P<0.01)。
3 讨论
肾小球和肾小管-间质损害是糖尿病肾病的重要表现，与肾功能的下降密切相关。肌成纤维细胞的出现是肾纤维化发生的一个重要标志，肌成纤维细胞兼具平滑肌细胞和成纤维细胞的生化和结构特性，是纤维化疾病中细胞外基质产生的主要来源，肌成纤维细胞的数量与糖尿病肾功能下降程度呈正相关[8]，这些细胞的起源不完全清楚。研究表明，近端小管上皮向细胞肌成纤维细胞的转分化是肌成纤维细胞形成的机制之一[9]。研究显示，TGF-β在近端肾小管上皮发生转分化的过程中起重要作用[3]。Smad信号蛋白是近年来发现的TGF-β家族下游信号转导蛋白，TGF-β介导的纤维化都涉及Smad信号通路 ......
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