稳定大鼠原位肝移植模型的建立(2)
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1.4.4 供肝的准备修剪供肝和血管袖套准备在0～4℃水浴中进行。一把显微镊夹持血管袖套套柄，另一把镊子穿过套管腔轻提肝下下腔静脉将血管袖套套在肝下下腔静脉外，无损伤血管钳夹住袖套柄，并用橡皮泥固定血管钳。外翻腔静脉，肾静脉结扎点暴露在袖套外，5-0丝线结扎固定。以相同的方法实行门静脉套管，幽门静脉结扎点暴露在袖套外，于水浴盆中浸泡备用。
1.4.5 受体手术
1.4.5.1 受体肝脏切除术前15 min肌注阿托品0.03 mg。乙醚麻醉，中上腹部正中取横切口，注意结扎左右腹壁下静脉后进腹，将肠管覆盖盐水湿纱布推向左侧腹部，充分暴露肝脏。钝性分离肾上段肝下下腔静脉，结扎肾上腺静脉，8-0缝线缝扎肝固有动脉。胆总管分叉处结扎并切断胆总管。钝性分离门静脉左右分支。切断镰状韧带，缝扎左膈下静脉，结扎并离断肝脏与食管间的静脉丛。小心分离下腔静脉后壁，远离下腔静脉缝扎右肾上腺静脉丛，注意血管床的严密止血，并在腹后壁与下腔静脉间插入1根橡皮条。肝下下腔静脉夹自右肾静脉上方夹闭肝下下腔静脉，移开乙醚筒停止乙醚吸入。于下腔静脉入肝处以一细直血管钳钳夹阻断，紧贴该钳下方离断赶下下腔静脉，断端以低分子右旋糖苷冲洗后，两侧角分别吊1针8-0显微外科线备用。门脉夹自幽门静脉处夹闭门静脉，开始无肝期。穿刺门静脉的分叉处，向肝内缓慢注入2 ml生理盐水直至肝脏变白。于门静脉左右分支留置牵引线。牵引橡皮条，哈巴狗钳经左侧膈下置入，连同部分膈肌夹闭肝上腔静脉。贴近肝脏剪断肝静脉，剪断门静脉，清理腹腔及止血。
1.4.5.2 供肝植入将供肝原位置入，摆好位置，冰盐水纱布覆盖。于供受体肝上下腔静脉左右两角各缝合1针做定位牵引，从左侧开始7-0线行连续外翻缝合后壁，至右侧脚时与原线结打结。连续外翻缝合前壁，至左侧脚时，再向前缝合1针后，与原线结打结。打结前向腔静脉注入生理盐水，并轻压肝脏以排尽空气。将肝叶翻向头侧，通过牵引线张开门静脉，用生理盐水排尽门脉套管及受体门脉内的空气及积血，将套管插入门静脉内，并结扎固定。顺序缓慢松开门静脉夹及肝上下腔静脉夹，开放肝脏血流，结束无肝期。此过程若有条件，可以由2人合作完成，加快速度，可在一定程度上减轻肝脏的冷缺血损伤，提高供肝的质量。术中可见供肝颜色迅速变红，若有局部灌注不良区可尝试通过按摩手段来改善，常可获得较好的效果。见肝下下腔静脉有血流出时，同法套合肝下下腔静脉。将各肝叶摆回其正常的生理位置，此时大鼠开始苏醒。经阴茎背静脉缓慢注入NaHCO3溶液1 ml，有一定的预防和纠正酸中毒的作用[5-6]。随后可见肝脏色泽更加鲜红，胆汁不断留出。受体胆总管前壁剪一小口，插入胆管支架，结扎固定，并与供体胆管的线尾打结，避免支架脱出。大网膜覆盖肝门，温生理盐水冲洗腹腔，查无出血，将肠管摆放回原来的生理位置，3-0丝线全层缝合皮下及皮肤。若麻醉深度适当，则除去固定后大鼠即可翻身站起、觅食。
1.5 术后处理
①分笼单独喂养，电炉烤火复温，环境温度应保持在22℃。②术后2 h起恢复饮水，12 h后饮水5%葡萄糖盐水。1 d后给予饲料。③所有死亡大鼠尽早进行尸检，无特殊情况术后不用抗生素。
2 结果
2008年4～6月，预实验共行大鼠原位肝移植60例。后16例全部长期存活(生存期大于2周者)，1个月存活率达75%。在此基础上，2008年7月～2008年10月，正式实验共行大鼠原位肝移植80例，手术成功率为80%。术后出血2例，胆漏1例，胆道梗阻2例，移植肝无功能3例。供体手术、供肝修理、受体手术时间分别为(27.0±3.1)、(11.0±2.1) min和(30.0±2.5) min。无肝期为13～19 min，平均为(15.0±2.6) min。SVC吻合时间2～4 min，平均为(3.0±0.8)min。结果见图1～3。
3 讨论
目前，虽然大鼠肝移植模型众多，但“二袖套法”(Kamada法)为应用最广泛的模型。在大量手术的基础上，本研究对经典Kamada法进行了技术改进，建立了一个较稳定的大鼠肝移植模型。手术中的问题和方法探讨如下：
3.1 供体手术
供肝在游离肝周韧带及血管的过程中，很难避免按压而影响局部微循环，造成局部缺血、低氧及炎症细胞浸润，并激活Kupffer细胞，再灌注后可释放大量的活性氧物质(ROS)和炎性细胞因子，最终加重肝脏的再灌注损伤[7]。因此，灌注前最好减少肝脏翻动。笔者体会：为提早进行供肝的冷灌注，适当延长供肝的冷缺血时间并不明显增加术后死亡率及并发症的发生，而术中过多地牵动供肝则会明显影响供肝的质量[8-9]。手术分离时尽可能去除血管壁周围的筋膜、结缔组织等，防止再通后造成套管腔狭窄及血栓形成。
3.2 供肝灌注
先松开门静脉夹，再松开肝下下腔静脉夹，均缓慢松开。灌洗压力过大容易引起供肝的细胞器肿胀、细胞坏死和淋巴细胞浸润，导致细胞内钙超载和能量代谢障碍，从而影响移植肝的质量。本研究采用的是经腹主动脉的灌注法，以1～2 ml/min的速度灌注腹主动脉，灌注液体经过肝动脉和门静脉系统回流入肝脏，从而保证肝脏得到充分、缓慢而均匀的灌注，提高供肝的质量。
3.3 袖套管放置
套管必须保证硬度适中、内壁光滑。由于不重建肝动脉，而胆道血供多由肝动脉供应，故供肝胆总管不应保留过长，有利于减少胆道并发症。在脾静脉水平安放门静脉袖套较为方便。在左肾静脉水平剪断IVC，有利于袖套的翻转。
3.4 受体手术
笔者在进腹时习惯取中上腹横切口，而此过程中笔者建议结扎左右腹壁下静脉，首先该血管相对较粗大，出血会影响术野，其次该血管的出血量相对于只有12～13 ml血容量的大鼠来讲会是术后出血性休克死亡的重要原因。受体术前15 min常规给予阿托品对于预防术后肺炎、肺不张有较好的效果[10]。供肝恢复血供后对于肝门部的处理，使用血供较好的大网膜覆盖，既有加压防止出血、使胆漏和胆道感染局限化的作用，同时可以适当供给胆道血供，可以预防胆道并发症的发生[11]。受体阻断门静脉后，经门静脉注入羟乙基淀粉注射液可将肝内残存的血液及时推入体循环，起到“自身输血”的作用。在SVC的吻合过程中，缝线不宜过紧，防止血管狭窄。供肝门静脉及IVC“套管法”吻合前，必须排出阻断夹后方的一段积血，以防止血栓栓塞。Pacheco等[12]研究表明，随门静脉淤血时间的延长，再灌注后因肠道内菌群移位而使内毒素骤升，如此可激活肝脏Kupffer细胞，产生大量的TNF-α及一系列的级联反应，从而对供肝及受者的肺脏产生损伤[7,13-14]。同时，IVC阻断时间的延长会导致血钾浓度显著升高。在供肝恢复血供的过程中 ......
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