高效液相色谱法测定棓丙酯注射液含量及有关物质(2)
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2.1.4 空白溶剂与空白辅料溶液试验精密量取空白溶剂10 μl，注入液相色谱仪检测，记录色谱图。精密量取空白辅料溶液1 ml，置100 ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液10 μl，注入液相色谱仪检测，记录色谱图，见图1。测定结果表明，辅料的色谱图与空白溶剂的色谱图基本相同，辅料溶液不干扰样品测定。
图 1 空白辅料干扰图谱
Fig.1 The chromatogram of interfering test for blank supplements
2.1.5 棓丙酯与没食子酸最小检出量测定精密量取棓丙酯注射液1 ml置100 ml容量瓶中，加流动相逐级稀释测定，当S/N≈3，样品浓度为0.09 μg/ml，进样量为10 μl，最低检出量为0.9 ng。精密称取没食子酸适量，加流动相逐级稀释测定，当S/N≈3，样品浓度为0.08 μg/ml，进样量为10 μl，最低检出量为0.8 ng。
2.1.6 没食子酸与棓丙酯的分离度试验取棓丙酯适量，加流动相适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，取上述溶液10 μl，注入液相色谱仪检测，记录色谱图，结果棓丙酯的保留时间约为7.75 min。取没食子酸适量，加流动相适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，取上述溶液10 μl，注入液相色谱仪检测，记录色谱图。另取上述没食子酸、棓丙酯溶液混合均匀，量取10 μl注入液相色谱仪，记录色谱图，结果二者的分离度(R)为13.9，表明没食子酸与棓丙酯主峰达到基线分离，分离度符合要求。
2.1.7 破坏性试验
2.1.7.1 酸破坏量取本品约0.5 ml置50 ml烧瓶中，加1 mol/L盐酸溶液20 ml，在电子控温电热套上回流30 min后，取出放冷，用碱溶液调至中性，加流动相定容至50 ml，滤过，取滤液10 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。
2.1.7.2 碱破坏量取本品约0.5 ml置50 ml烧瓶中，加1 mol/L氢氧化钠溶液20 ml，在电子控温电热套上回流30 min后，取出放冷，用酸溶液调至中性，加流动相定容至50 ml，滤过，取滤液10 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。
2.1.7.3 氧化破坏量取本品约0.5 ml，置三角瓶内，加10%过氧化氢溶液20 ml，在电炉上小火煮沸5 min，取出，放冷，加流动相定容至50 ml，过滤，取滤液10 μl注入液相色谱仪，记录色谱图。
上述结果表明，本品在酸、碱、10%过氧化氢溶液中都有不同程度的破坏降解，但降解产物能与样品主峰基本分离，在该色谱条件下能有效地测定本品有关物质。
2.1.8 样品有关物质测定取本品1 ml置100 ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1 ml置100 ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。量取对照溶液10 μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分峰高为满量程的10%～25%，量取上述两种溶液各10 μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍，供试品溶液的色谱图中如显杂质峰，量取各杂质峰面积之和与对照溶液主峰面积比较(1.0%)，测定结果见表1。结果表明，3批样品的有关物质均小于1.0%。自身对照法与面积归一法计算有关物质，其结果基本一致。
表 1 3批样品有关物质测定结果(%)
Tab.1 The results of the related substance determination in three batches of samples(%)
2.2 含量测定
本品主要的有关物质没食子酸与主药的紫外吸收特征基本一致(其水溶液在272 nm的波长处均有较大吸收)，利用紫外分光光度法对本品进行含量测定时，不能排除没食子酸对测定结果的干扰。为提高含量测定方法的科学性，本文采用高效液相色谱法对主药棓丙酯与杂质(没食子酸)在色谱柱中分离后进行测定。
2.2.1 色谱条件与系统适用性试验同有关物质测定项下。
2.2.2 线性关系试验精密称取棓丙酯对照品约95 mg，置100 ml容量瓶中，加流动相超声溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密量取上述溶液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 ml置100 ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，分别量取上述溶液10 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，以平均峰面积(A)为纵坐标，浓度(C)为横坐标，进行线性回归，得回归方程为A=1 157.60+60 654.75C，相关系数r=1.000。结果表明，样品浓度在19.02～57.06 μg/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2.2.3 稳定性试验取上述38.04 μg/ml的对照品溶液室温放置8 h，分别在0、1、2、4、6、8 h进样10 μl，其平均峰面积为2 197 616.05，RSD为0.08%，表明稳定性良好。
2.2.4 精密度试验取上述38.04 μg/ml的对照品溶液，分别连续进样6次，测定其峰面积，其平均峰面积为2 201 738.5，RSD为0.06%，表明此方法进样精密度良好。
2.2.5 回收率试验精密称取经105℃干燥至恒重的棓丙酯对照品适量(高43.2 mg，中36.0 mg，低28.8 mg各3份)，共9份，置100 ml容量瓶中，模拟棓丙酯注射液的处方及工艺配制成样品，加流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取1 ml置100 ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另取经105℃干燥至恒重的棓丙酯对照品约36 mg，精密称定，加流动相制成每毫升中含36 μg的溶液，作为对照品溶液，取供试品溶液与对照品溶液各10 μl注入液相色谱仪 ......
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