6His-hVEGF165融合基因真核表达载体的构建和鉴定(2)
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1.3 方法
1.3.1 hVEGF165 cDNA的克隆
设计一对P1、P2引物(根据GenBank公布的hVEGF165的cDNA序列AB021221),并在引物上、下游两端分别添加BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点。引物序列为,P1:5’-GGA TCC GAT GAA CTT TCT GCT GTC TTG G-3’;P2:5’-CTC GAG CCC GCC TCG GCT TGT CAC ATC-3’。引物设计及酶切位点分析软件:Primer Premier 5.0。序列相似性分析软件:DNAssist 1.0。
1.3.1.1总RNA提取:用Ficoll淋巴细胞分离液提取人总RNA,取5 μl样品行1%琼脂糖凝胶电泳。
1.3.1.2 经两步法RT-PCR反应,PCR反应条件为:94℃预变性4 min;94℃ 10 s,55℃ 30 s,72℃ 1 min,共30个循环;最后72℃延伸8 min。反应结束后立即加入1 U Taq DNA聚合酶进行加A反应,在72℃条件下延伸10 min。此后进行1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR结果。
1.3.1.3 PCR产物的回收及PCR产物与pMD19-T载体的连接:PCR产物的回收按胶回收试剂盒说明书进行,取5 μl回收产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。依照pMD19-T Simple Vector操作手册施行连接反应的具体步骤,反应条件为:12℃反应16 h。
1.3.1.4 连接产物转化感受态细胞,提取质粒并进行双酶切鉴定,在冰浴上解冻DH5α感受态细胞,然后加入连接产物20 μl,混匀后冰浴30 min,42℃水浴90 s,冰浴2 min,加入不含Amp的LB培养基800 μl,37℃摇床培养40 min,室温下2 000 r/min离心3 min,保留LB培养基重悬菌体100 μl,将5% X-Gal 16 μl和0 ......
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