应用PCR-反向斑点杂交快速鉴定分枝杆菌菌种(1)
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[摘要] 目的:应用聚合酶链反应-反向斑点杂交法(PCR-RDBHA)快速鉴定分枝杆菌至种的水平。方法:以分枝杆菌rpoβ基因编码序列为靶基因,应用PCR-RDBHA检测126株分枝杆菌临床分离株。以PCR-DNA测序为对照,对经PCR-RDBHA鉴定为非结核分枝杆菌(NTM)的临床分离株进行PCR-DNA测序。结果:126株临床分离株中,经鉴定115株(91.3%)为结核分枝杆菌复合群(MTC),11株(8.7%)为NTM。NTM中,4株胞内分枝杆菌,1株堪萨斯分枝杆菌,1株戈登分枝杆菌,2株瘰疬分枝杆菌,3株脓肿分枝杆菌。11株NTM PCR-RDBHA与PCR-DNA测序结果一致。结论:PCR-RDBHA能鉴定分枝杆菌临床分离株至种的水平,方法简便、快速,结果准确,具有良好的临床应用价值。
[关键词] 分枝杆菌;菌种鉴定;聚合酶链反应;反向斑点杂交
[中图分类号] R378.91[文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2010)03(c)-035-02
PCR-reverse dot blot hybridization assay for rapid identification of Mycobacterium species
ZHANG Xiaojuan
(Thorax Disease Hospital of Shenyang, Shenyang 110044, China)
[Abstract] Objective: To identify Mycobacterium species rapidly by polymerase chain reaction-reverse dot blot hybridization assay (PCR-RDBHA). Methods: 126 mycobacterial clinical isolates were detected by PCR-RDBHA based on the sequence of rpoβ gene. PCR-DNA sequencing of the nontuberculous mycobacteria (NTM) identified by PCR-RDBHA was performed as control. Results: Among 126 isolates, 115 (91.3%) were determined to be M.tuberculosis complex (MTC), 11 (8.7%) to be NTM which contained 4 M.intracellulare, 1 M.kansasii, 1 M.gordonae, 2 M.scrofulaceum and 3 M.abscessus. The results of 11 NTM identified by PCR-RDBHA were in agreement with PCR-DNA sequencing. Conclusion: It is simple, rapid, accurate and valuable in clinical application that PCR-RDBHA is applied to identify mycobacterial clinical isolates to species level.
[Key words] Mycobacterium; Species identification; Polymerase chain reaction; Reverse dot blot hybridization assay
目前,常规的分枝杆菌菌种鉴定需采用分枝杆菌培养物进行生长特性试验(生长速度、生长温度、光产色试验、多种鉴别培养基上生长试验)及生化特性试验(耐热触酶试验、硝酸盐还原试验、烟酸试验、吐温-80水解试验、尿素酶水解试验、芳香硫酸酯酶试验、铁离子吸收试验、亚硝酸盐还原试验)等10余项试验,综合分析判定结果[1],方法复杂、费时,慢生长分枝杆菌需3～4周方可获得结果,且准确度较差,难以满足临床诊断和治疗的需要。本实验以分枝杆菌rpoβ基因为靶基因序列,应用聚合酶链反应-反向斑点杂交法(PCR-RDBHA)快速鉴定分枝杆菌临床分离株至种的水平,结果报道如下:
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 分枝杆菌分离株经抗酸染色涂片检测阳性的分枝杆菌临床分离株126株,来自我院结核科和解放军第三〇九医院。
1.1.2 引物及探针引物Ⅰ和Ⅱ及21种分枝杆菌寡核苷酸探针序列参照文献[2]由上海生工生物工程有限公司合成。引物Ⅰ和Ⅱ扩增360 bp DNA片段。分枝杆菌属、结核分枝杆菌复合群、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、胃分枝杆菌、偶然分枝杆菌、龟分枝杆菌、海分枝杆菌、猿猴分枝杆菌、戈登分枝杆菌、苏加分枝杆菌、马尔摩分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、微黄分枝杆菌、土地分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、不产色分枝杆菌和草分枝杆菌菌种对应的探针分别命名为pMyc、pTub、pAvi、pInt、pKan、pAbs、pScr、pGas、pFor、pChe、pMar、pSim、pGor、pSzu、pMal、pXen、pFla、pTer、pSme、pNon和pPhl。
1.2 方法
1.2.1 DNA模板制备刮取改良罗氏培养基上的分枝杆菌临床分离株培养物少许,混悬于含1 ml无菌TE缓冲液的1.5 ml离心管内,10 000 r/min离心10 min,去上清,沉淀加入DNA提取液50 μl,煮沸15 min,离心取上清作为DNA模板。
1.2.2 PCR扩增在25 μl反应体系内,引物Ⅰ、引物Ⅱ终浓度各为0.2 μmol/L,4× dNTP终浓度各为0.2 mmol/L,Taq DNA聚合酶1 U,10× PCR缓冲液2.5 μl,DNA模板3 μl,加去离子水至25 μl。置PCR扩增仪内,扩增条件为94℃变性5 min后,94℃ 1 min、58℃ 1 min和72℃ 1 min,循环35次,72℃延伸7 min。2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
1.2.3 探针加尾20 μl 5× 末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)反应缓冲液,探针终浓度为4 μmol/L,dTTP终浓度为2 mmol/L,TdT 80 U,加去离子水至100 μl,置37℃水浴2 h,加2 μl 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)终止反应。
1.2.4 反向斑点杂交①膜芯片制备:取加尾后探针2 pmol按顺序点于尼龙膜上(图1),置60℃干烤固定2 h。②杂交:将生物素标记的PCR产物煮沸变性5 min,冰浴5～10 min。将膜芯片放入反应袋中,加入杂交液(5× SSC,1% blocking试剂,0.1%十二烷基肌氨酸钠,0.02% SDS)5 ml,加入变性PCR产物15～20 μl,混匀,封袋。54℃孵育30 min。③洗膜芯片:洗液Ⅰ(2× SSC,0.1% SDS)室温洗膜2次,每次10 min;洗液Ⅱ(0.1× SDS,0.1% SDS)室温洗膜10 min 1次。④酶结合物与标记PCR产物结合:链亲和素-碱性磷酸酶结合物以适当比例稀释后与杂交后的膜芯片室温作用30 min。⑤洗膜芯片:缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl,150 mmol/L NaCl,pH 7.5)室温洗膜2次,每次10 min,缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl,100 mmol/L NaCl,50 mmol/L MgCl2,pH 9.5)室温洗膜10 min 1次。⑥显色:用BICP-NBT系统显色,待探针显色后,用TE洗膜终止反应。⑦结果观察:根据杂交斑点判定结果。
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