葛根素对溶血磷脂酰胆碱诱导血管平滑肌细胞基质金属蛋白酶-9表达的影响(2)
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1.2 SMCs的原代培养
原代培养采用组织贴块法,培养液为20%胎牛血清加DMEM培养液。取大鼠胸主动脉,中间剪开,放入D-Hank液中冲洗,剥净外膜后用弯头吸管轻轻刮除内膜,撕取内2/3层中膜组织,剪成约1 mm2的小组织块接种于培养瓶内。培养瓶至于37℃、5% CO2培养箱内,待SMCs贴壁4 h后加培养液1 ml,然后置于37℃、5% CO2培养箱内培养24 h后补液至5 ml,以后每隔3~5 d换液,倒置显微镜下动态观察细胞生长情况。细胞生长融合出现“峰与谷”后,用含0.125%胰蛋白酶和0.01% EDTA的混合消化液传代培养。第三代细胞用抗α-actin肌动蛋白免疫组化进行鉴定。实验用第3~7代细胞,按5×105个/ml接种于6孔板中培养。待细胞融合后,换用无血清的DMEM培养液培养24 h,使细胞同步化,然后即可进行分组实验。
1.3 实验分组
实验共分为四组,正常对照组:SMCs中不加任何试剂;LPC处理组:不同浓度(1.0~10.0 mg/L)的LPC孵育SMCs 24 h;葛根素组:根据葛根素浓度(10-6~10-4 mol/L)的不同分为三个亚组,在每个亚组中先加入葛根素预处理4 h,然后加入5.0 mg/L的LPC孵育24 h;PDTC组:PDTC预先孵育SMCs 2 h,然后加入5.0 mg/L的LPC作用24 h。
1.4 实时荧光定量PCR检测MMP-9 mRNA的表达
细胞完成相应处理后,用Trizol提取各处理组细胞总RNA,逆转录合成cDNA第一链,取cDNA进行PCR扩增。MMP-9引物序列,上游:5’-CTT CGA GGG CCA CTC CTA CT-3’,下游:5’-CAG TGA CGT CGG CTC GAG T-3’(129 bp);GAPDH引物序列,上游:5’-CCT CAA GAT TGT CAG CAA T-3’,下游:5’-CCA TCC ACA GTC TTC TGA GT-3’(141 bp)。
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