输尿管部分梗阻后平滑肌细胞中游离Ca2+浓度改变
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输尿管平滑肌细胞的分离[5]：①PBS溶液的制备；②酶消化液：Ⅱ型胶原酶1 g/L，牛血清白蛋白1 g/L；③输尿管平滑肌细胞的制备：将成模的大鼠用10%水合氯醛腹腔注射(0.3 ml/100 mg)麻醉后，迅速游离出左侧输尿管，标本取出后于10%青霉素溶液中浸泡5 min，再用PBS缓冲液冲洗3次，在自制平台(在35 mm培养皿中倒入PBS缓冲液，把滤纸剪成适当大小铺于培养皿中，利用滤纸的摩擦力固定输尿管)上除去输尿管周围脂肪及表面结缔组织，将输尿管剪成肉糜后用PBS缓冲液冲洗至无血，将其置于EP管离心后，吸取上清PBS缓冲液后转移至0.1%Ⅱ型胶原酶溶液中，在37℃环境下振荡消化约3.5 h，当消化液混浊，组织块呈絮状时提示消化良好，加入1 g/L牛血清白蛋白中止消化。反复吹打絮状组织块后静置5 min，吸出混悬液。混悬液离心(1 000 r/min，离心半径13 cm)5 min，沉淀的细胞移入培养皿中。
1.3 输尿管平滑肌内钙离子浓度的测定
1.3.1 输尿管平滑肌细胞的Fura-2/AM负载将酶消化完毕的输尿管平滑肌细胞用PBS缓冲液制成单细胞悬液，将单细胞悬液在显微镜下调整每毫中含细胞数约为106，加入浓度为5 μmol/L的Fura-2/AM作为Ca2+的荧光指示剂，保持35℃ 45 min，用PBS冲洗两次备用。以上过程需避光。
1.3.2 输尿管平滑肌细胞内游离钙离子浓度的测定在倒置显微镜下选好进行测定的细胞，510 nm为发射波长，以340 nm和380 nm为激发波长，进行细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]c)的测定。具体来说，在激发荧光波长为340 nm 左右时，结合物荧光强度上升；而在激发荧光波长为380 nm时，其荧光强度会下降；在Fura-2的等消光点360 nm时，其荧光强度与结合的Ca2+浓度无关。这样， [Ca2+]c 可以直接由两个激发波长上的荧光强度的比值来计算，即双激发波长荧光法。选择对钙离子不敏感的激发波长360 nm 则可以用来反应全细胞吸波后荧光染料扩散进细胞的过程以及监视细胞内荧光染料的总量变化的过程，具体计算公式如下：
[Ca2+] c=Keff (R-Rmin)/(Rmax-R) R=F1/F2
其中Keff为有效结合常数，F1为波长340 nm激发的荧光强度，F2则为380 nm 激发的荧光强度。R为F1与F2的比值，Rmin是在零钙浓度下的最小荧光比值，Rmax则为在高钙浓度(10 mM)时的最大荧光比值[6]。
1.4 统计学方法
统计学处理采用SPSS 17.0软件，计量资料采用均值±标准差(x±s)表达，各组间均数比较采用单因素方差分析。以P<0.05为有统计学意义。
2 结果
成模的40只大鼠中，16周实验组和8周实验组因感染、肠粘连等原因死亡和经压力测定筛选后分别有15只和16只完成实验。16周和8周对照组分别有17只和18只完成实验。
测定平滑肌细胞游离细胞内钙离子荧光比值结果示：在8周PUUO组的大鼠输尿管平滑肌中Ca2+的平均荧光比值为(200.42±36.34)，8周对照组(187.63±23.51)，8周PUUO组细胞内游离Ca2+荧光比值高于同期对照，其差异无统计学意义(P>0.05)，在16周PUUO组的大鼠输尿管平滑肌中Ca2+的平均荧光比值为(454.92±31.69)，16周对照组(173.88±35.44)，16周PUUO组细胞内游离Ca2+荧光比值明显高于同期对照组(P<0.05)。见图1、表1。
图1 大鼠输尿管平滑肌细胞在不同时间点的荧光比值
表1 8周和16周平滑肌细胞内游离钙离子浓度
(荧光比值)的比较(x±s)
Tab.1 The compares of cytosol-free calcium concentration in smooth muscle in 8 weeks and 16 weeks (x±s)
注：与对照组比较，P<0.05
3 讨论
近几年来，尽管对于上尿路梗阻的研究取得了一定的进展，但肾脏仍是研究重点。而本研究小组将梗阻的输尿管作为研究对象，并在前期试验中证实了PUUO模型中梗阻输尿管肌条的收缩力和收缩频率分别在不同梗阻时期的相应变化[7]。因此，本实验在分子水平上探讨PUUO模型中游离Ca2+的变化，以期为输尿管平滑肌功能学变化提供分子学依据。
分子机制决定了器官的形态和功能的变化，而形态的改变决定了其功能的变化，因此，对分子机制的研究显得尤为重要。众所周知，钙是维持细胞正常功能、结构的重要物质基础。在生理状态下，胞浆内钙离子浓度约为10-7 mol/L，而细胞外钙浓度为胞内钙离子浓度的10 000倍。在正常生理情况下细胞通过其转运机制可保持这种巨大的浓度差，以维持胞内低钙状态，但一些有害因素可使钙离子平衡系统失调，导致钙离子分布紊乱，最终细胞内钙浓度异常升高，即发生了钙超载。钙超载是通过以下两方面引起细胞受损：①线粒体通透性转运体(PTP)的开放，PTP 开放时许多大分子非选择性地由胞浆向线粒体扩散，导致线粒体膜电位的破坏和功能障碍，细胞内钙超载时，Ca2+也可与PTP相结合，导致线粒体肿胀，功能失调，均能引起细胞死亡[8]；②酶的激活，钙蛋白酶活性增加并引起外钙内流，接着钙蛋白酶从胞质中转移到细胞上，从而引起Cl-内流和细胞溶解死亡[9]。
本科研小组在前期试验已证实在大鼠输尿管梗阻后，8周时试验组输尿管平滑肌收缩力和收缩频率与对照组相比均增加[7]，α1-AR及Gq/11与β-actin灰度比值显著高于对照组，且差异均有统计学意义[10]。8周实验组输尿管肌条自律性收缩力增加，α1-AR及Gq/11与β-actin灰度比值高与大鼠自身的代偿机制有关[10]。在无任何治疗情况下，16周时，PUUO实验组输尿管平滑肌的收缩力和收缩频率比对照组均降低[6]。α1-AR及Gq/11与β-actin灰度比值低于对照组，均表现为失代偿。本实验结果显示在造模8周时，测定输尿管平滑肌细胞内静息钙离子荧光比值比正常差异略有增加，但差异无统计学差异，这与PUUO大鼠输尿管肌条收缩力增加的代偿机制有关。梗阻发展到16 周时, PUUO大鼠输尿管平滑肌细胞内游离钙离子荧光比值与对照组大鼠相比出现明显的改变，即细胞内钙超载的发生，对输尿管平滑肌超微结构与其收缩肌运送尿液的功能进一步损害 ......
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