干扰STAT3的siRNA真核表达载体对人卵巢癌的侵袭转移性的相关研究(2)
 |
| 第1页 |
参见附件(3041KB，3页)。
1.2.2 STAT3、siRNA转录模板的设计及合成[5]从GenBank中查找人STAT3基因的全长序列，根据siRNA的设计原则，设计STAT3特异寡核苷酸序列，在设计的寡核苷酸序列两端分别引入两个酶切位点，加入9个碱基对的茎环结构，3′末端加有转录终止序列TTTTT，以形成发夹状siRNA寡核苷酸链序列：STAT3正义链5′-GATCCATCCAGAGTCACTGGAAGTTTCAAGAGAAGTTCCAGTGACTCTGGATTTTTTTGTCGACA-3′，反义链5′-AGCTTGTCGACAAAAAAATCCAGAGTCCACTGGAACTTCTCTTGAAAGTTCCAGTGACTCTGGATG-3′。同时建立无同源性序列的non-target siRNA为阴性对照，正义链5′-GATCCTTCTCCGAACGTCTCACGTTTCAAGAGAACGTGCACG TTCGGAGAATTTTTTGTCGACA-3′，反义链5′-AGCTTGTCGACAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGAAG-3′(由上海博亚公司合成)。
1.2.3 siRNA-STAT3表达载体的构建将合成的引物退火缓冲液作用下退火，与经过BglⅡ、HindⅢ双酶切的质粒pSilencer2.1-U6-neo连接，热转化至大肠杆菌DH5α中，37℃过夜培养，碱裂解法快速抽提质粒。
1.2.4 细胞转染将处于对数生长期的SKOV3细胞和人正常卵巢细胞经0.25%胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，接种于24孔培养板，于37℃、5%CO2培养箱内培养，保证转染时细胞汇合达70%~80%；将LipofectamineTM 2000用无血清培养液稀释，然后将稀释的siRNA-STAT3、空质粒与稀释的LipofectamineTM 2000，轻轻混合均匀后放于37℃、5%CO2培养箱内培养24 h后，吸去无血清培养液，加入含10%FBS的细胞培养基继续培养。
1.2.5 Western blot检测STAT3蛋白的表达实验分成五组：正常卵巢细胞对照组、正常卵巢细胞siRNA-STAT3组、SKOV3细胞对照组、SKOV3细胞空质粒转染组及SKOV3细胞siRNA-STAT3组。提取各组细胞总蛋白，定量后用蛋白上样缓冲液调整浓度，取25 μg上样，进行SDS-PAGE电泳，将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，常规封闭后，加入一抗4℃过夜，再加入用辣根过氧化物酶标记过的二抗37℃下孵育2 h，ECL显色。
1.2.6 Transwell侵袭小室及侵袭相关蛋白MMP-2的检测将SKOV3细胞对照组、SKOV3细胞空质粒转染组及SKOV3细胞siRNA-STAT3组细胞用含1%FBS的培养基配制成细胞悬液，调整细胞浓度为5×108个/L，取稀释好的Matrigel 25 μl加入Transwell小室底部膜的上室面，覆盖整个聚碳酯膜，放入37℃培养箱中孵育30 min，使Matrigel聚合成凝胶，取配制好的细胞悬液100 μl加入小室上室面，然后将24孔板下室加入600 μl含20%FBS的培养基于37℃、5%CO2培养箱内常规培养24 h后，取出小室上室，用PBS洗两遍，然后用湿棉签轻轻擦去凝胶和聚碳酯膜上的细胞，小心取出上室，用冰预冷的甲醇固定30 min后，行Giemsa染色。在高倍镜下(×200)随机选取10个不同视野的肿瘤细胞进行计数，取平均数。将三组细胞蛋白提取出后，按Western blot检测STAT3蛋白的表达的步骤检测侵袭相关蛋白MMP-2的表达水平。
1.3 统计学方法
采用SPSS 11.3统计软件进行分析，数据以均数±标准差(x±s)表示，两样本均数比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Western blot检测转染细胞STAT3蛋白的表达
正常卵巢细胞对照组、正常卵巢细胞siRNA-STAT3组、SKOV3细胞对照组、SKOV3细胞空质粒转染组和SKOV3细胞siRNA-STAT3组的STAT3蛋白相对表达量分别为(0.33±0.19)、(0.33±0.06)、(0.83±0.14)、(0.82±0.18)、(0.35±0.18)。SKOV3细胞siRNA-STAT3组STAT3蛋白表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。
1.正常卵巢细胞对照组；2.正常卵巢细胞siRNA-STAT3组；3.SKOV3细胞对照组；4.SKOV3细胞空质粒转染组；5.SKOV3细胞siRNA-STAT3组
图1 siRNA-STAT3对各组细胞中STAT3蛋白表达水平的影响
2.2 siRNA-STAT3对卵巢癌细胞侵袭能力的影响
与SKOV3细胞对照组和SKOV3细胞空质粒转染组相比，SKOV3细胞siRNA-STAT3组穿过基底膜的细胞数显著减少(P<0.05)。而SKOV3细胞阴性对照组和SKOV3细胞阴性对照组穿过基底膜的细胞数无明显差别。见表1。
2.3 siRNA-STAT3对卵巢癌细胞中侵袭转移相关蛋白表达水平的影响
SKOV3细胞siRNA-STAT3组中MMP-2蛋白的表达水平降低，差异有高度统计学意义(P<0.01)；而SKOV3细胞阴性对照组与SKOV3细胞对照组中MMP-2蛋白的表达无明显差异，差异无统计学意义(P>0.05)。见图2、表2。
3 讨论
STAT3是近些年来发现的一种重要的核转录因子，是JAKs 激酶-信号转导和转录活化因子(JAKs-STATs)转导途径中的一员，对肿瘤的发生发展起着重要作用。STAT3在人体正常组织中很少或没有活化，而在乳腺癌、头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)、卵巢癌、前列腺癌、恶性黑色素瘤、宫颈癌、淋巴瘤、多发性骨髓癌和各种白血病等中存在持续激活的STAT3蛋白[6]，已被归为癌基因。Briggs等[7]发现，STAT3可在血管内皮生长因子(VEGF)基因启动子区域由结合位点持续激活，诱导VEGF表达，导致肿瘤新生血管形成 ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(3041KB，3页)。