单叶蔓荆种质资源遗传多态性的RAPD分析(2)
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2.2 随机引物的筛选
按照各模板DNA的浓度计算所取体积，最终配置该含有等浓度7种DNA样品的混合样品(Pool)，对160个随机引物进行筛选，得到10个条带较多且清晰、多态性较好的引物。见表2。
2.3 扩增
RAPD-PCR反应体积为25 μl，其中包括1×buffer、2.5 mmol/L MgCl2、100 μmol/L dNTP、0.2 μmol/L引物、1 U Taq酶及30 ng模板DNA。扩增条件为：94℃预变性3 min；94℃预变性30 s，40℃预变性60 s，72℃预变性90 s，40个循环；72℃预变性5 min；4℃保存。
2.4 RAPD扩增产物检测
从上述10个条带中随机选取两个引物进行PAPD扩增产物检测，即P20和P27。取5 μl扩增产物加1 μl上述缓冲液，混匀，于含0.05%溴化乙锭的0.7%的琼脂糖凝胶上电泳检测，电极缓冲液为0.5×TBE，电压为5 V/cm，Maker 2 000为参照，用紫外凝胶成像系统拍照，电泳结果见图1。
2.5 数据记录与统计
RAPD为显性标记，同一引物扩增产物中电泳迁移率一致的条带被认为具有同源性。将PCR扩增的DNA电泳条带作为位点记录下来，若某个扩增条带在一个样品中出现，记作“1”，未出现的记作“0”。原始数据的整理采用Excel软件，利用NTSYS-2.10e软件进行遗传相似系数计算和UPGMA方法聚类分析，结果分别见表3和图2。
3 讨论
3.1 蔓荆基因组DNA的提取
在提取DNA之前，新梢和叶片在0.9%的蔗糖水溶液中暗培养48 h可以降低淀粉、色素等干扰物质对DNA提取的干扰。本研究采用CTAB小量法提取DNA，所得基因组DNA的提取率和纯度都比较高，对DNA样品进行RAPD扩增分析，结果表明，这些DNA样品均可以扩增出谱带，且扩增带型清晰度较高，有效地排除了叶绿素及次生代谢产物对PCR扩增结果的影响。另外模板中残留的氯仿、异丙醇等小分子有机物会影响Taq酶活性，为了得到纯度较高、有保证的扩增结果，最好用70%乙醇抽提2～3次，然后以含Rnase的TE缓冲液溶解，排除样品中少量RNA的影响。因为提取过程中各重复结果之间也会出现一定的差别，所以在使用之前每管所得DNA模板都必须在测定浓度之后，根据浓度确定PCR所需模板DNA溶液的体积，否则可能会导致条带不清晰、假阳性等异常结果。
3.2 各产地野生蔓荆RAPD标记遗传多样性
本实验利用RAPD分子标记对我国蔓荆子主要产地山东、江西、安徽等7个地区的野生蔓荆进行了遗传多态性分析，从160条RAPD引物中筛选出扩增条带清晰、重复性高的引物10条(表1)。RAPD扩增的条带在250～2 500 bp之间，10条引物共扩增出88条带，多态性条带为46条，多态性比率为52.3%。
由聚类分析(图2)可见，各种质之间均存在一定的遗传差异，7个样本大致可以分为4组，在相似系数0.84的水平上V3和V5聚为一组，V6和V7聚为一组，而在0.80的水平上V1和V2聚为一组，V4单独一组。说明V3和V5、V6和V7相似系数较高，V1和V2次之，另外，V1、V2、V3、V5之间的遗传相似性较强，而它们与V4、V6、V7的遗传关系较远。这种遗传关系可能是在人工引种的基础上[8]，由长期的自然变异导致的，尚需进一步的考证。
3.3 小结
根据吴永忠等[9]的报道，其测定的样品中山东牟平姜格庄、江西星子蓼花和江西都昌多宝与本研究所采样品在地域分布上相距较近，可以认为是来自相同产区的样品；研究发现，江西两地所产蔓荆子药材中蔓荆子黄素含量为0.218 9%和0.197 6%，是山东牟平所产蔓荆子含量(0.074 3%)的2~3倍。而本研究结果显示，V2(山东牟平)与V5(江西多宝)之间的遗传相似性要高于V5与V6(江西都昌)之间的遗传相似性，是什么因素导致了蔓荆子化学多样性与其种质的遗传多态性之间的差异呢？初步判断可能由以下原因造成：第一，RAPD分析的遗传多态性并不一定能够体现相关化学成分合成途径中关键基因的表达差异，本实验数据显示，各种质之间均具有一定程度的遗传差异，但所有的种质之间的最大遗传差异为0.307(表3中V7与V2、V4的交叉处)，这充分说明对于蔓荆而言种内的遗传关系总体来说是较近的，而少量遗传物质的差异是否直接与相关化学成分的合成有关还不得而知；第二，环境因素对相关化合物含量的影响可能大于遗传距离的影响，干旱、盐碱等胁迫条件是否促进了植物的逆境应答，在应答机制里面相关成分是否起到了重要作用。以上研究都与植物逆境生理及植物功能基因组学有着密切的关系，这些问题的解答必将促进药用植物化学多样性与遗传多态性的关系研究，同时为药材资源的整理、创新以及规范化栽培提供科学参考。
[参考文献]
[1] 曹元宇.神农本草经[M].上海:上海科学技术出版社,1987:220.
[2] 国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京:中国医药科技出版社,2010:340-341.
[3] 陆大忠,朱山寅.蔓荆子与混淆品牡荆子的比较鉴别[J].中药材,1999,22(4):179-181.
[4] 靳光乾,郭庆梅,刘善新,等.不同产区蔓荆子扫描电镜观察[J].中国中医药信息杂志,2007,14(10):34-35.
[5] Williams J G K, Kubelik A R, Kenneth J L, et al. DNA polymorphism samplified by arbitrary primers are useful as genetic markers [J] ......
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