心肌缺血期应用环孢素A对大鼠心肌功能的影响(2)
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[Key words] Ischemia/reperfusion injury; Myocardial protection; Mitochondrial permeability transition pore (mPTP); Cyclosporin A; Rats
在大鼠心肌缺血期进行短暂双下肢缺血处理(remote conditioning，RP)可以减少再灌注性心律失常(reperfusion arrhythmia，RA)[1]、减少心肌梗死。线粒体是心肌细胞的生死之门，线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)是非选择性极高的线粒体内膜通道，是心肌细胞致死性再灌注损伤的决定性因素，也是心肌保护的最新靶点[2]。通过大鼠冠状动脉结扎模型发现采用预处理方式应用mPTP开放抑制剂环孢素A(CsA)，能够通过和线粒体基质的亲环蛋白D(cyclophilin D，CyP-D)结合抑制mPTP开放，在再灌注过程中发挥心肌保护作用[3]。本实验采用心肌缺血期应用CsA，评价其心肌保护能力，探讨心肌缺血期应用CsA抑制mPTP开放对心肌的可行性。
1 材料与方法
1.1 实验动物与试剂
成年健康雄性Wistar大鼠42只，体质量250~410 g，平均(340±59)g，购自湖北省疾病预防控制中心。水合氯醛为国产化学纯；Evan′s Blue及氯化三苯四氮唑(tetrazolium，TTC)购自美国Sigma公司；CsA购自北京双鹭药业股份有限公司，250 mg/5 ml，以生理盐水稀释为10 mg/ml。啮齿动物人工呼吸机DH-150，浙江大学医学仪器厂；Powerlab 16道生理记录仪、压力及生物放大器、1050.1型压力换能器，澳大利亚AD Instrument公司。
1.2 动物模型制备及分组
大鼠称重，10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，气管切开，随后插入16 G套管针(直径2 mm)，连接动物人工呼吸机进行机械通气，通气量3~4 ml/100 g，通气频率60次/min，吸呼比1∶1，不需连接输氧装置。沿胸骨纵行切开皮肤，沿胸骨正中剪开至第3前肋水平。在左心耳根部下方2~3 mm处以心脏表面左冠状静脉主干为标志，用5-0无创缝合针穿过心肌表层，在肺动脉圆锥旁出针。结扎30 min后松结扎线，持续观察180 min建立模型。①Sham组(n=8)：将缝线穿过左冠脉前降支下方，但不结扎。②IR组(n=12)：结扎30 min，再灌180 min。③RP组(n=12)：心脏操作同IR组，在心肌缺血起始时捆绑双下肢5 min，以肢体远端发紫，不能触及股动脉搏动为准，松开5 min，反复3次。④环孢素A组(CS组，n=10)：心脏操作同IR组，心肌缺血期，经心腔测压管一次性注入CsA 10 mg/kg[4]。持续心电监测，经心腔测压管监测左心室压力变化[5]。
1.3 标本处理
实验终点行Evan′s blue染色，Sham组5只，IR组6只、RP组7只、CS组5只进行染色处理。实验终点，冠状动脉结扎点原位结扎，经心腔测压管注射2%Evan′s blue约为2.5 ml，适当夹闭主动脉根部，以促进Evan′s blue进入冠状动脉内，待球结膜蓝染后，心腔注射10%KCl 0.1 ml，使心脏停跳于舒张期，然后切取心脏。冰生理盐水冲洗后，去除心底大血管，左、右心房及右心室，入-80℃冻存待检。未行Evan′s blue染色的标本取心脏穿线部位与心尖之间的中上2/3的左心室前壁心肌组织以4%甲醛固定，24 h后行常规石蜡包埋，备用。
1.4 检测指标
1.4.1 再灌注性心律失常的判断与评分 观察记录心肌缺血期及再灌注期间出现的室性心律失常情况并计分，评分参考Curtis等[6]报道的评分规则。具体如下：0分，无心律失常；1分，偶发性室性早搏(1 min 内发生3次以下的室性早搏)；2分，频发性室性早搏(1 min内发生3次或3 次以上的室性早搏)；3分，偶发性室性心动过速(1 min内发生3次以下的室性心动过速)；4分，频发性室性心动过速(1 min内发生3次或3次以上的室性心动过速)或偶发性室颤(1 min内发生3次以下的室颤)；5分，频发性室颤(1 min内发生3次或3次以上的室颤)或死亡。
1.4.2 血流动力学变化 监测记录左心室最大收缩压(LVSPmax)，左心室压力上升/下降最大速率(±dp/dtmax)。
1.4.3 心肌HE染色比较 四组各取5个未进行Evan′s blue染色的心脏标本，经4%甲醛固定后，常规石腊包埋，制作光镜切片，观察心脏组织学改变。
1.4.4 心肌梗死范围染色比较 取染色心脏标本自然升温到0℃左右时，从心尖部向心底部横向切成1~2 mm厚度薄片4~6片，放入1%TTC PBS中(pH=7.40)37℃孵育20 min。用蒸馏水中止反应，将切片浸入4%的甲醛中24 h增强颜色对比。存活心肌呈砖红色，梗死区不着色呈灰白色，把心肌片用水冲去多余的染料，并排置于滤纸上吸干水分，放在两玻片间夹持固定，以固定焦距数码相机拍摄各切片图象，用Photoshop 8.01软件分析心肌缺血范围及心肌梗死范围。心肌缺血范围(%)=心肌缺血范围/心肌片面积之和×100%，心肌梗死面积(%)=(梗死面积之和/心肌缺血范围)×100%。其中Sham组因无明显心肌梗死范围，不便图像分析，不进行心肌梗死范围比较。
1.5 统计学方法
采用SPSS 13.0软件包进行统计处理。计量数据以均数±标准差(x±s)表示，多组间数据以one-way ANOVA进行分析 ......
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