阿魏酸钠胶囊与片剂在健康人体的生物等效性研究(2)
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2.2 血浆样品处理方法
精密量取血浆200 μl加入内标替硝唑(15.57 μg/ml)20 μl，加入50 μl(0.6 mol/L)HCl溶液，混匀，加入萃取剂乙酸乙酯1 600 μl涡旋震荡2 min，4 000 r/min离心10 min后取上清液，40℃氮气吹干。100 μl流动相复溶，震荡1 min后取20 μl进样分析，以内标法峰面积比定量。
2.3 方法专属性考察
精密量取空白血浆200 μl，按“2.2”项下自“加入50 μl(0.6 mol/L)HCl溶液”依法操作得空白样品色谱图1(A)；将一定浓度的阿魏酸对照溶液(1.0 μg/ml)加入空白血浆，按“2.2”项下自“加入50 μl(0.6 mol/L)HCl溶液”依法操作得含阿魏酸血浆样本色谱图1(B)；将一定浓度的阿魏酸对照溶液(1.0 μg/ml)加入空白血浆，按“2.2”项下依法操作得含阿魏酸及内标的血浆样本色谱图1(C)；取受试者给药后采集的血浆样品200 μl，按“2.2”项下依法操作，得色谱图1(D)。检测器波长均为320 nm。见图1。
2.4 标准曲线和定量下限
在空白血浆中加入不同浓度阿魏酸标准溶液20 μl，配制成相当于阿魏酸血浆浓度为0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、1.20、1.80 μg/ml的样品，按“2.2”项下依法操作，以待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，待测物浓度为横坐标，并用加权(1/χ2)最小二乘法进行线性回归运算，求得的直线方程即为标准曲线。结果得线性方程为Y=1.139X-0.001，表明阿魏酸在0.05～1.80 μg/ml范围内线性关系良好，最低可定量为0.05 μg/ml(S/N>10)。
2.5 提取回收率试验
将不同浓度的阿魏酸的对照溶液20 μl加入180 μl空白血浆中，配制成高、中、低三个浓度(1.60、1.00、0.06 μg/ml)血浆样品各3份，按“2.2”项下操作，得到阿魏酸峰面积值A1；另取空白管，配置相应浓度的阿魏酸对照溶液，不做萃取直接检测，得到阿魏酸峰面积值A2。按公式提取回收率(%)=A1/A2×100%来计算阿魏酸的提取回收率。结果阿魏酸在上述3个浓度水平的提取回收率分别为91.33%、85.74%、85.97%。
2.6 精密度试验
取空白血浆加入不同浓度阿魏酸对照溶液，配制阿魏酸高、中、低3个不同血浆浓度(1.60、1.00和0.06 μg/ml)的质量控制(QC)样品，连续测定3 d，结果表明日内、日间相对标准差(RSD)<15%。
2.7 稳定性试验
取空白血浆加入不同浓度阿魏酸对照溶液，配制阿魏酸高、中、低3个不同血浆浓度(1.60、1.00、0.06 μg/ml)的样品，分别考察血浆样品在室温放置0 h和8 h、在-20℃冰箱中反复冻融3次、冷冻条件下放置10 d和15 d的稳定性，结果显示，按“3.2”项下操作室温放置0、8 h，-20℃冰箱中反复冻融3次和长期冷冻RSD<15%，稳定性较好。
2.8 血药浓度-时间数据和药代动力学参数
20名受试者口服阿魏酸钠胶囊和片剂后的平均血药浓度-时间曲线见图2。主要药动学参数见表1。
2.9 生物等效性评价
将ln(AUC(0~4))、ln(AUC(0~∞))、ln(Cmax)经方差分析和双单侧t检验，结果显示两种制剂在吸收程度和达峰浓度上等效。tmax经非参数检验(配对Wilcoxon法)，差异无统计学意义(P>0.05)，表明两制剂在达峰时间上等效。单次口服受试制剂的相对生物利用度为(104.4±19.7)%。见表2。
3 讨论
本实验建立了HPLC-UV测定人血浆中阿魏酸钠含量的方法。笔者参考有关文献[8-11]对血浆样品处理方法进行筛选，选用0.6 mol/L HCl酸化血浆样品，使其易与蛋白分离。为了提高检测灵敏度，笔者先后考察了采用乙醚和乙酸乙酯两种有机溶剂进行提取，发现酸化后的样品经乙酸乙酯提取，提取回收率不仅高而且内源性物质干扰少，为阿魏酸钠体内药物浓度分析和药物动力学研究提供了依据。
20名健康志愿受试者分别口服100 mg阿魏酸钠受试制剂与参比制剂后，经检测得到血浆中阿魏酸钠主要药动学参数并进行方差分析，进一步采用双向单侧t检验和[1-2α]置信区间法进行生物等效性评价，结果均在等效范围内，证明两种制剂为生物等效制剂。
[参考文献]
[1] 王勇,邢宝恒,史丹丹.阿魏酸钠对重度子痫前期患者蛋白尿的疗效观察[J].中国医药导刊,2011,13(3):457-458.
[2] 刘力群,周丹丹,韩凤文.阿魏酸钠临床疗效研究[J].黑龙江医药,2010,23(1):96-97.
[3] 邹连琦,李玉华,邹峰.阿魏酸钠治疗冠心病疗效观察[J].中国医药,2010,5(5):393-394.
[4] 谷艳,刘爽,杨青兰,等.探讨缺血性脑血管病的临床诊治体会[J].中国现代药物应用,2010,4(9):108-109 ......
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