浓缩丹参骨宝颗粒中水溶性有效成分的质量控制研究(2)
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1.供试品溶液；2.丹酚酸B对照品溶液；3.阴性对照溶液
图1 供试品、丹酚酸B对照品、阴性对照溶液TLC色谱
2.3 含量测定
2.3.1 供试品溶液的制备 取研细的样品0.3 g，精密称定，加入20%甲醇25 ml，称重，超声10 min，放冷至室温，用流动相补足减失的重量，0.45 μm膜滤过，取续滤液，即得。
2.3.2 对照品溶液的制备 分别精密称取丹参素钠、丹酚酸B对照品适量，置于25 ml容量瓶中，用20%甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度分别为152 μg/ml和292 μg/ml的对照品混合液。
2.3.3 色谱条件及系统适应性 色谱柱为Hypersil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为甲醇(A相)-0.5%冰醋酸水溶液(V/V，B相)进行线性梯度洗脱：0～9 min：10%A，9～20 min：10%A～60%A，20～30 min：60%A～10%A；检测波长为281 nm；流速为1.0 ml/min；柱温为30℃。在上述色谱条件下，取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各20 μl，分别进样，HPLC分析，记录色谱图。丹参素和丹参酚酸B的理论塔板数大于5 000。试验结果表明，色谱系统适应性良好。阴性对照无显著色谱峰，表明空白溶剂不干扰样品的检测。见图2。
2.3.4 线性关系考察 精密量取对照品储备液0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、1.6 ml，分别置于10 ml量瓶中，加甲醇定容到刻度，摇匀即得系列浓度的对照品溶液。分别取配制好的各浓度对照品溶液20 μl，依次进样，记录峰面积积分值。以进样含量X(μg/ml)为横坐标，峰面积积分值Y为纵坐标，绘制标准曲线。经计算得丹参素的线性回归方程为Y=0.084 52X+0.368(r=0.999 6)，丹参酚酸B的线性回归方程为Y=0.078 57X+0.682(r=0.999 8)。计算结果表明丹参素和丹参酚酸B分别在3.0～24.0 μg/ml和6.0～48.0 μg/ml范围内线性关系良好。
2.3.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液，按照上述色谱条件连续进样6次，每次进样量20 μl，以各药物成分峰面积计算RSD。计算得丹参素和丹参酚酸B的日内精密度RSD分别为1.20%和0.68%，表明试验方法精密度良好。
2.3.6 重复性试验 取同一批号的样品，按照供试品溶液配制方法，制备6份供试品溶液，按上述色谱条件进样分析，计算丹参素和丹参酚酸B的含量分别为0.26 μg/ml和5.63 μg/ml，RSD分别为1.60%和0.94%，表明该试验方法的重复性良好。 2.3.7 稳定性试验 取相同供试品溶液，分别在0、1、2、4、6 h进样测定丹参素和丹参酚酸B的峰面积，计算RSD。结果两种药物成分的RSD分别为1.30%和0.86%，表明供试品溶液在6 h内稳定。
2.3.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的样品，配制成一定浓度的供试品溶液，分别加入丹参素和丹参酚酸B的对照品溶液，按上述色谱条件测定并计算回收率。见表1。
2.3.9 样品含量测定 取3个批号的样品，按照供试品溶液配制方法操作，进样20 μl，按色谱条件测定峰面积，外标法计算样品标示的百分含量。见表2。
表2 样品含量测定结果(n=3)
3 讨论
在薄层色谱鉴别试验中，本文参照《中国药典》2010年版丹参的鉴别方法[8]进行。由于本品主要含丹参水溶性成分，不含丹参脂溶性成分(如丹参酮等)，因此在此研究中将方法略作修改，药典中75%甲醇溶解改为20%甲醇，主要是增加水溶性成分的溶解度，提高测定的准确性。
在HPLC试验中，对药剂成分丹参素和丹参酚酸B做紫外光谱扫描发现，丹参素的最大吸收波长是281 nm，丹参酚酸B的最大吸收波长是286 nm。由于制剂中丹参素的含量较小，为提高准确性，选择测定波长为281 nm。结果表明在该条件下，两种有效成分的检测线性关系良好。
在HPLC试验中，由于样品物质丹参素和丹参酚酸B的化学结构中具有酸性羧基，在酸性流动相中色谱峰的对称性良好，峰形尖锐，有利于防止拖尾，经预试验在流动相中添加0.5%的冰醋酸能取得较好的峰形效果。
在本制剂中，丹参骨宝水溶性有效成分丹参素及丹参酚酸B的含量较高。丹参素是多羟基酚酸，在空气中加热易氧化，丹参酚酸B是由三分子的丹参素和一分子的咖啡酸结合而成，在有效成分提取、浓缩及制剂过程中，应严格控制各环节工艺参数，防止丹参酚酸B的分解以及丹参素的氧化，以保证制剂具有较高的水溶性活性成分含量。
[参考文献]
[1] 杜冠华,张均田.丹参现代研究概况与进展[J].医药导报,2004,23(7):355-359.
[2] 肇毅,潘立勤.丹参促进创伤修复机制的研究现状[J].南京中医药大学学报,2000,16(4):253-254.
[3] 张晓燕,吴铁,崔燎,等.丹参水提物对去卵巢大鼠牙槽骨骨量的影响[J] ......
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