基于反相液相色谱的人血中茶碱浓度临床检测与分析(2)
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取空白血清中茶碱浓度为2、4、20 μg/ml低、中、高溶液同日内测定5次，连续5 d，每天测定1次，计算日内精密度、日间精密度。见表1。
表1 茶碱日内、日间精密度试验结果(n=5)
2.8 稳定性试验
取空白血清中茶碱浓度为2、4、20 μg/ml每一浓度进行5个样本分析，考察茶碱血清样品经历冷冻——解冻循环的稳定性。见表2。
表2 茶碱稳定性试验结果(n=5)
2.9 回收率试验
取空白血清中茶碱浓度为2、4、20 μg/ml低、中、高溶液，按按“2.4”项下血清样本的处理过程操作，同时以流动相代替空白血清，配制2、4、20 μg/ml浓度的茶碱标准溶液。以血清样品与标准品峰面积比值计算提取回收率，由同步操作制备的标准曲线计算每个血样的实测浓度，将求得的浓度与已知加入浓度相比，计算血样茶碱的相对回收率。见表3。
表3 茶碱提取及相对回收率试验结果(n=5)
2.10 临床应用
对呼吸科、老年科、ICU连续使用茶碱6 d血药浓度达稳态时的住院患者(共计36例)，于次日早上7：00左右空腹取血行茶碱的血药物浓度检测。结果显示，患者茶碱血药浓度在2～26 μg/ml之间。见表4。
表4 36例住院患者茶碱血药浓度的测定结果
3 讨论
3.1 茶碱血药浓度检测方法的选择
目前，常用茶碱的测定方法有高效液相色谱法(HPLC)、紫外分光光度法(UV)、荧光偏振免疫分析法(FPIA)、化学发光酶免疫法(CLEIA)。紫外分光光度法测定茶碱的血药浓度[3-4]在这几种方法中成本最低，但灵敏度及分辨率差，计算麻烦；荧光偏振免疫分析法和化学发光酶免疫法操作简单，专属性高，但荧光偏振免疫分析法需要TDx仪来测定血药浓度，价格昂贵；化学发光酶免疫法定标有效期短[5-7]。本实验对茶碱血药浓度的检测，首先考虑方法有效性(专一性强、灵敏度好、变异系数低、回收率高)，其次是周期短、成本低、样本处理简单等因素，故采用高效液相色谱法。
3.2 HPLC法检测茶碱血药浓度的条件选择
3.2.1 流动相的选择 在HPLC测定茶碱的方法中，目前文献报道的茶碱测定的流动相选择主要为醋酸盐缓冲液-乙腈[8]、甲醇-水[9]、磷酸二氢钾-乙腈[10]、甲醇-水-醋酸溶液[11]、三乙胺缓冲液-甲醇[12]，笔者对比了流动相甲醇-水和甲醇-水-醋酸盐缓冲溶液两者的保留时间和峰面积基本一致，甲醇-水-醋酸盐缓冲溶液峰形更尖锐，峰高更高。两者都能对茶碱进行很好的色谱分析，但甲醇-水作为流动相廉价易得，更为经济，而且比使用含有醋酸缓冲液的流动相更能延长分析柱的寿命，因此本文建议采用甲醇-水为流动相。同时也发现流动相中随着甲醇比例的提高，茶碱的保留时间明显缩短，当甲醇比例太高，茶碱组分分离效果不理想。通过预试验最后确定甲醇-水(25∶75)作为流动相。此比例茶碱的出峰时间亦在5 min左右，保留时间均在15 min以内，是主峰出峰时间的3倍。而且被测成分分离效果较好，峰形也良好。
3.2.2 样本处理方法的选择 血浆样品的处理方法有萃取法、蛋白沉淀法等。二氯甲烷-异丙醇[13]、氯仿-异丙醇萃取[14]。萃取法的血样本干扰少，最低检测限高。但其操作繁琐，操作一致性和稳定性较差，同时有机溶剂(如氯仿)对人体伤害大。有文献报道蛋白沉淀法选用三氯醋酸、高氯酸、甲醇等作为蛋白沉淀剂，前两者提取回收率较高，但考虑到酸性沉淀剂可能损坏色谱柱，故选用甲醇沉淀蛋白[15]。
3.3 临床茶碱监测与分析
影响血药浓度的因素是多方面的，它与药物剂型、给药剂量、给药间隔、给药方式、患者的生理状况、病理状况等是密切相关的。茶碱的药理作用与血浓度有关，其有效血浓度安全范围很窄，茶碱浓度维持在5～15 μg/ml可达到较好的疗效，超过20 μg/ml即能引起毒性反应[16]。
茶碱血药浓度监测者中有4例大于20 μg/ml，可能原因：第一，与患者的肝肾功能异常有关，使茶碱的清除率下降，半衰期延长。第二，与其他药物配伍使用有关，如氟喹诺酮类等可降低茶碱清除率，增加其血药浓度。第三，与患者高龄生理状况有关，老年人血浆蛋白减少，会使游离型药物增多；机体水分减少，脂肪增加，药物血药浓度增高，不良反应增加。有9例血药浓度小于5 μg/ml，一是可能诱导了P450肝药酶，如酗酒、吸烟等，使其血药浓度下降。二是与其他药物配伍使用有关，如钙拮抗剂以及偏酸性的药物。三是给药剂量、间隔不当，正常成年人茶碱的半衰期为(8.7±2.2) h，如1日1次普通片剂或是尽管1日2次普通片剂，但2次间隔很近或是剂量不足，不能达到有效的血药浓度。这些因素都会影响茶碱在体内的分布、吸收、代谢及排泄，从而影响了患者体内的血药浓度。尽管影响茶碱的血药浓度因素有很多，但是依据此方法检测出的数据，并做适当的调整，使茶碱的给药剂量更加安全、有效。
[参考文献]
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