球形红细菌生物转化槲寄生中总三萜类化合物的测定(2)
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参见附件。
2.2 三萜类化合物的测定及对比研究[5-9]
2.2.1 对照品溶液的配制 精密称取齐墩果酸对照品20 mg，置于100 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.2 mg/ml的齐墩果酸对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液的配制 取10 ml待测样品溶液，减压蒸干，加乙醚适量回流提取至提取液无色，挥干溶剂，加甲醇稀释至刻度，摇匀。因样品中总三萜含量相差很大，如果不在线性范围内，做适当稀释后测定。
2.2.3 最大吸收波长的确定 分别取经显色后的对照品及供试品溶液，在200～800 nm范围内扫描。结果表明，样品、对照品均在535 nm处有最大吸收，故选择535 nm作为测定波长。
2.2.4 专属性试验 取经显色后的常规光合细菌培养基(即阴性对照，按“1.2”项下方法配制)，在200～700 nm范围内扫描。结果在535 nm处没有吸收，说明选择535 nm作为测定波长，阴性对照无干扰。
2.2.5 标准曲线及线性范围的考察 精密吸取上述对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 ml，分别置具塞的试管中，挥去溶剂，准确加入5%的香草醛-冰醋酸溶液和1.00 ml高氯酸，混匀，在60℃恒温水浴中加热15 min，冰水浴中冷却至室温，加入5.00 ml的冰乙酸，转移至10 ml量瓶中，加乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀(浓度用C表示)，在535 nm处测定吸光度(A)。线性方程为A=21.988C-0.072，相关系数r=0.989 5，线性范围为2～12 μg。
2.2.6 精密度试验 取对照品溶液0.4 ml，按“2.2.5”项下方法显色，连续测定5次，测得含量的RSD=1.13%，表明分析方法精密度良好。
2.2.7 重现性试验 取同一批样品5份，按“2.2.2”项下方法配制供试品溶液，按“2.2.5”项下方法测定，测得含量的RSD=3.12 %，表明分析方法重现性良好。
2.2.8 稳定性试验 取经显色后的供试品溶液，在1 h内每隔10 min测吸光度1次，30 min内测得含量的RSD=3.65 %，以后吸光度相差很大，故测定应该在显色后30 min内测定。
2.2.9 加样回收率试验 取已知总三萜含量的培养液5 ml，分别加入对照品溶液3、5、7 ml。按“2.2.2”项下方法配制供试品溶液，按“2.2.5”项下方法测定，计算回收率。见表2。
表2 回收率测定结果(n=3)
2.2.10 样品含量测定及比较 取样品溶液分别制备供试品溶液，在535 nm处测定吸光度，如超出线性范围，稀释至适当倍数测定，表1中1~9号样品总三萜类含量(n=3)分别为1.80、0.22、4.34、4.44、2.10、0.22、0.18、0.24、0.01 mg/ml。
3 讨论
本研究结果显示，槲寄生水提取液(样品2)及槲寄生水提取液的球形红细菌转化液(样品6、7、8)，其总三萜含量都很低，说明水不能将槲寄生药材中的三萜类提取完全；75%的乙醇提取、半量常规培养基、游离球形红细菌细胞培养，所得培养液(样品3)总三萜含量和槲寄生75%的乙醇提取液(样品1)相比增加141%，说明经过球形红细菌转化可以增加槲寄生提取液中的总三萜的含量；样品4和样品3相比，总三萜含量稍有增加，说明固定化球形红细菌在一定条件下有利于样品中总三萜类化合物的转化，但球形红细菌固定化后不适合药用，需要进一步考虑；另外，样品4和样品5中总三萜含量相比增加111%，说明培养液中不添加常规培养基，适合固定化球形红细菌对槲寄生药材中三萜类化合物的转化，使总三萜的含量增加。由此可见，在不同的条件下，对各种类型化合物的最佳转化条件是不同的，也体现了中药全成分生物转化的复杂性。本文建立槲寄生及球形红细菌转化槲寄生培养液中总三萜类化合物的含量测定方法，并对槲寄生及PSBT中各含量进行比较研究。为球形红细菌转化槲寄生化学成分和转化机制研究奠定基础。
[参考文献]
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