阿托伐他汀对强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞体外干预后Toll样受体2、Toll样受体4的表达变化研究(2)
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参见附件。
[Key words] Ankylosing spondylitis; Toll like receptors; Atorvastatin
强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一种常见的炎症性疾病，它以骶髂关节和脊柱慢性炎症为主要表现。AS由于其低下的生活质量和较高的致残率而受到众多关注。AS的治疗仍然是全世界风湿病学家面临的难题，其难点之一是缺乏有效的治疗药物，传统的改善病情抗风湿药物(disease modifying antirheumatic drugs，DMARDs)治疗AS的疗效有限，众多风湿病学专家也致力于新研究药物的开发和应用，以寻找更有效的抗炎药物。Yokota等[1]研究表明他汀类药物可下调类风湿关节炎患者由TNF-a引起的IL-6和IL-8的增高。Nagashima等[2]研究显示他汀类药物可以促进类风湿关节炎患者滑膜细胞的凋亡，而且极有希望被用于治疗类风湿关节炎[3]。他汀类药物已经在临床显示出其有效的抗炎作用，由于此类药物可以减弱脂多糖的作用，专家们认为其是通过抑制天然免疫起作用的[4]。本研究通过观察天然免疫分子Toll样受体2(TLR-2)、Toll样受体4(TLR-4)在AS患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)的mRNA水平表达以及阿托伐他汀体外干预AS患者PBMC的研究，观察Toll样受体(TLRs)的表达差异，探讨AS治疗的可能的突破点，寻找新的治疗AS的途径和方法。
1 材料与方法
1.1 材料
患者30例，其中，男27例，平均年龄30.6岁；女3例，平均年龄28.6岁，均为风湿免疫科住院AS患者，将其作为AS患者组，均符合1984年修订的纽约诊断标准[5]，病情活动期，得到患者同意后抽取肘静脉血12 ml，EDTA抗凝，置4℃保存，另选取健康志愿者30例作为健康志愿者组，两组年龄、性别等一般资料差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。阿托伐他汀药物原粉由北京红惠公司赞助。RT-PCR引物由上海生物有限公司合成。
1.2 方法
①取4 ml静脉血缓慢加于淋巴细胞分离液上面，2 000 r/min，离心20 min。用尖细玻璃管缓慢将分离到的中间层PBMC转入离心管，PBS洗涤2次。离心管底可见白色沉淀，在沉淀中加1.0 ml的Trizol。反复抽吸匀浆液以剪切基因组DNA，将样品转移到无菌1.5 ml离心管中，12 000 r/min，4℃，5 min。上清加入200 μl氯仿，剧烈振荡混匀30 s。室温放置5 min，12 000 r/min，4℃，10 min。重复上一步骤，吸取上清至另一1.5 ml离心管里加入等体积的异丙醇，混匀静置数分钟。12 000 r/min，4℃，离心10 min。用70%酒精洗涤沉淀2次，真空离心干燥3~5 min，沉淀用30~50 μl DEPC-H2O溶解。取2.0 μl RNA样品，紫外分光光度计A260波长下测得RNA浓度，置-80℃保存。使用Fermentas逆转录试剂盒按照说明进行逆转录。TLR-4引物，Forward primer(5′-3′)：5'-GAC CTG TCC CTG AAC CCT A-3'；Reverse primer(5′-3′)：5'-AAA TGT TGC CAT CCG AAA-3'；扩增产物380 bp。TLR-2引物，Forward primer(5′-3′)：5'-GGC CAG CAA ATT ACC TGT GTG-3'；Reverse primer(5′-3′)：5'-CTG AGC CTC GTC CAT GGG CCA CTC C -3'；扩增产物639 bp。β-actin引物，Forward primer(5′-3′)：5'-CCA AGG CCA ACC GCG AGA AGA TGA C-3'；Reverse primer(5′-3′)：5'-AGG GTA CAT GGT GGT GCC GCC AGA C-3'；扩增产物为592 bp。72℃，7 min，RT-PCR 32个循环。PCR产物进行DNA琼脂糖凝胶电泳和电泳条带分析：Labwork凝胶成像系统紫外光下成像分析，并应用附带软件分析目标条带与内参β-actin条带吸光度值之比，进行半定量分析。②取EDTA抗凝血4 ml加入等体积的PBS液稀释并混匀，将稀释的血液8 ml加入含有4 ml淋巴细胞分离液的15 ml离心管中，室温下离心2 000 r/min，20 min。吸取交界处PBMC层并移入另一个15 ml离心管中；加入8 ml PBS混悬细胞；室温下离心2 000 r/min。20 min，弃上清；用8 ml PBS再次混悬细胞，室温下离心2 000 r/min，20 min，弃上清；用含10%胎牛血清的1640培养液稀释混悬细胞，分配至24孔培养板，一份标本转入两孔，使浓度为1×106/孔，总体积为2 ml/孔，一孔用阿托伐他汀(终浓度为0.01 mmol/L)刺激，自身对照孔不予用药，均在37℃ CO2恒温孵育箱为中连续培养细胞24 h后，无菌EP管收集，离心后弃上清，留取细胞。用PBS洗涤细胞2次，提取细胞总RNA，进行逆转录合成cDNA及PCR扩增(同上)。
1.3 统计学方法 ......
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