靶向舌癌Tca8113细胞血管内皮细胞生长因子基因的siRNA表达载体构建及体外抑制作用(2)
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参见附件。
1.2.2 重组载体的酶切和测序 重组的Pu-VEGF-siRNA和Pu -HK载体转化感受态DH5α细菌，50 μg/mL的Ampr抗性LB培养皿筛选阳性克隆，质粒提取试剂盒按说明提取重组载体。SalⅠ酶切重组载体，测序鉴定。
1.2.3 重组载体的转染 10%小牛血清的RPMI-1640培养基培养Tca8113细胞，于37℃、5%CO2孵箱中培养至对数生长期。以每孔1×106/mL细胞接种24孔培养板并培养过夜。按说明书使用Lipofectamine 2000将含有重组Pu-VEGF-siRNA和Pu-HK载体分别转染Tca8113细胞。实验分为三组，转染Pu-VEGF-siRNA为实验组，转染Pu–HK载体组作实验对照组，未转染组作空白对照组。实验组和实验对照组G418筛选1周后得到稳定转染细胞克隆。
1.2.4 免疫组织化学染色分析Tca8113细胞血管内皮细胞生长因子蛋白表达 常规SABC法检测Tca8113细胞VEGF的蛋白表达，各组随机选取100个Tca8113染色细胞，使用MIAS-2000医用彩色病理图像免疫组化测量系统对其灰度值进行测定。
1.2.5 酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbentassay，ELISA)测定Tca8113细胞上清液的血管内皮细胞生长因子蛋白表达 按照ELISA试剂盒操作说明进行操作，收集各组Tca8113细胞培养上清液，使用OD值作纵坐标，标准品浓度作横坐标，进行标准曲线绘制。根据Tca8113细胞上清OD值在标准曲线中可以查出对应浓度。
1.3 统计学方法
采用SPSS 13.0统计学软件进行处理。计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示，多组间的比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 重组载体酶切鉴定
质粒Psilence 2.1-U6-neo基因序列里没有SalⅠ酶切位点，本研究插入的序列里设计有SalⅠ酶切位点，Pu-VEGF-siRNA和Pu-HK质粒均能被SalⅠ酶切，即均为插入正确的质粒(图1)。
2.2 重组载体基因测序
经酶切鉴定的重组质粒送往上海生工公司进行DNA全长测序。所得结果如图2~3。经Blaster对比，测序结果与GenBank的VEGF基因序列完全一致，证实重组载体构建成功。
2.3 免疫组织化学染色SABC法分析Tca8113细胞血管内皮细胞生长因子蛋白表达
结果如图4~6所示，实验组细胞与实验对照组及空白对照组比较，细胞着色颗粒明显减少，而且着色变浅。对照组灰度值比实验组的明显降低(P < 0.05)。实验对照组与空白对照组比较差异无统计学意义(P > 0.05)。
2.4 酶联免疫吸附法测定Tca8113细胞上清液血管内皮细胞生长因子蛋白表达
实验组细胞与实验对照组及空白对照组比较，VEGF蛋白浓度有所降低(P < 0.05)。以实验对照组VEGF相对水平作参照，实验组浓度下降34.64%。与空白对照组比较，蛋白质量浓度相似，差异无统计学意义(P > 0.05)。见图7。
3 讨论
RNAi(RNA interference)是指由小分子双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，相应mRNA发生降解而导致基因表达沉默，它具有高稳定性、靶向性和高效率性等特点[4]，目前已经成为筛选新基因、基因功能研究、基因疾病治疗和寻找药物靶点的重要工具[5-7]。
本实验以人VEGF基因作为RNAi的靶基因，目的通过VEGF siRNA靶向阻断或抑制VEGF的表达，达到阻断或抑制VEGF促舌癌血管形成，进而抑制舌癌细胞增殖和转移的目的。VEGF mRNA的剪切方式的不同可产生5种不同形式蛋白分子：VEGF 206、VEGF 189、VEGF 165、VEGF 145、VEGF 121。不同的VEGF分子协同作用促进肿瘤血管形成[8]。本实验利用基因重组技术，根据基因数据库已知VEGF mRNA序列，参考siRNA的设计有关文献，设计针对VEGF mRNA公共序列的靶点，体外构建Pu-VEGF-siRNA重组载体，然后利用转染技术将其转染Tca8113细胞并使其在细胞中稳定表达。常规SABC法和ELISA检测Tca8113细胞VEGF的蛋白表达结果表明：转染Pu-VEGF-siRNA重组载体后，实验组Tca8113细胞的VEGF蛋白表达较空白对照组和实验对照组有所减弱，而且空白对照组和实验对照组的VEGF蛋白表达无明显差异；说明所构建的真核表达载体Pu-VEGF-siRNA对人舌癌细胞株Tca8113中VEGF有较强的特异性抑制效果。这与其他学者[8]构建针对VEGFmRNA公共序列靶点，体外构建重组载体，转染相应癌细胞后有效抑制VEGF表达结果一致。
笔者通过构建Pu-VEGF-siRNA重组载体并体外转染舌癌Tca8113细胞，实验结果表明能够特异和有效地抑制癌细胞VEGF的表达。这为应用RNA干扰技术对舌癌进行基因治疗提供了实验基础和理论依据，为舌癌的治疗选择开辟了新的途径。
[参考文献]
[1] Castro-Rivera E，Ran S，Thorpe P，et al. Semaphorin 3B(SEMA3B) induces apoptosis in lung and breast cancer，whereas VEGF165 antagonizes this effect [J]. Proc Natl Acad Sci USA，2004，101(31)：11432-11437.
[2] Chen J，Wen YM，Li LJ，et al. Expression of vascular endothelial growth factor in oral squamous cell carcinoma [J] ......
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