BrdU免疫组织化学染色方法的改进(漂片法)
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参见附件。
1.5 统计学方法
随机选取每只大鼠位置相同的5张不连续切片，光学显微镜下(×200)计数每张切片双侧海马齿状回颗粒细胞层(granular cell layer，GCL)免疫反应阳性细胞数。阳性细胞的均数作为统计数据，以均数±标准差(x±s)表示。用SPSS 10.0软件作方差分析(one-way ANOVA)检测组间差异性。
2 结果
2.1 踏转轮运动对成年大鼠齿状回细胞增殖的作用
经过6 d的踏转轮运动训练后，各组BrdU阳性细胞见图1。免疫组织化学结果显示，海马齿状回BrdU阳性细胞数，对照组为(22.55±1.91)个/切片，踏转轮组为(57.89±1.90)个/切片，两组相比差异有高度统计学意义(P < 0.001)。由此可见，踏转轮运动可增加BrdU阳性细胞，促进齿状回细胞增殖。
a、a′为对照组， b、b′ 为踏转轮组。a、b分别是a′、b′的高倍视野
图1 踏转轮运动6 d后海马齿状回BrdU阳性细胞数
2.2 不同的封闭液对组织片染色效果的影响
末次给药后24 h处死动物，从前囟后3.3~5.1 mm作连续冰冻切片，将切片随机分成三组。在染色过程中，这三组分别加入羊血清、胰酶抑制剂和牛血清白蛋白作为封闭液和终止胰酶作用的抑制剂。各组BrdU阳性细胞如图2所示。免疫组织化学结果显示，三种方法均能使BrdU着色，但各组的本底颜色和非特异性着色程度不同：羊血清组中虽然阳性细胞与非特异性着色细胞有明显区别，但非特异性着色细胞显色度较深，且遍布整个视野。胰酶抑制剂组阳性细胞与非特异性着色细胞也有明显差异，而且非特异性着色细胞显色度较浅，整个本底相对较为干净、清爽。牛血清白蛋白组几乎见不到非特异性着色细胞，本底颜色非常淡。
除了本底颜色和非特异着色的观察外，笔者还重点观察了组织切片的破损情况。实验结果显示：牛血清白蛋白和胰酶抑制剂组无切片破损，而羊血清组有少部分脑片破损。细胞计数显示：羊血清组为(23.22±2.38)个/切片，胰酶抑制剂组为(22.54±2.12)个/切片，牛血清白蛋白组为(23.14±3.12)个/切片，各组间差异无统计学意义(P > 0.05)。
3 讨论
自从20世纪末神经干细胞发现以来，其目前已经成为神经科学研究的热点之一。而研究在体或移植后的神经干细胞的增殖、迁移、分化中常用的标记新生细胞的方法有BrdU、3H、Ki-67、 PCNA(proliferating cell nuclear antige)[2-3]，前两者在细胞增殖时整合入细胞以后，即使在细胞静止期仍能表达；后两者是细胞增殖过程中表达的内源性蛋白，当细胞处于静止期时，它们并不表达。因此，BrdU和3H是常用的追踪细胞的标记物，而BrdU的检测又较3H更为方便、简单，所以BrdU是最为常用的标记细胞增殖的标记物。
丰富环境对神经发生有影响，而在各种环境因素中，运动对其影响较为显著[4-5]。本课题的前期研究建立了踏转轮运动的模型[6]，并发现运动对神经发生的作用具有强度依赖性，这早于国内外的相关报道[7-8] 。故本课题选用运动作为促进细胞增殖的方法，观察了不同的染色方法对切片及结果的影响。
组织切片BrdU染色时，常用的方法有贴片法和漂片法。漂片法与贴片法相比有一定的优点：前者能使抗体从两侧渗透，更有利于抗体与抗原充分反应，相应的在洗片时，也能使未结合的抗体充分漂洗干净；漂片法比贴片法所使用的抗体数量少，而且必要时抗体还可以回收，重复利用。标本量大时，漂片法比贴片法更省时、省力。但是，用漂片法进行BrdU染色时，由于在加入抗体前要用盐酸和胰酶对脑片进行预处理，经过处理(尤其是胰酶处理)后，进行染色的脑片极易破损，从而导致整个染色过程无法正常完成，或最终所得到的脑片极少。因此，在本实验中针对胰酶的消化作用，笔者分别选用了与二抗同源的羊血清、牛血清的主要成分白蛋白(牛血清白蛋白)及胰酶抑制剂来抑制(或终止)胰酶的消化作用。
羊血清是免疫组织化学中常用的封闭液，但是，在本实验中并未取得预期的成果，虽然羊血清能终止胰酶的消化作用，但并未能有效地封闭非特异性染色。其原因目前仍不清楚，有待进一步研究。胰酶抑制剂(取自火鸡蛋清)组和牛血清白蛋白组非特异性染色较少，尤其是牛血清白蛋白组。其原因可能是二者的成分单一，纯度较高。
[参考文献]
[1] Brent AR，Weiss S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system [J]. Science，1992，255(5052)：1707-1710.
[2] Cameron HA，Mckay RD. Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus[J]. J Comp Neurol，2001，435(4)：406-417.
[3] Kee N，Sivalingam S，Boonstra R，et al. The utility of Ki-67 and BrdU as proliferative markers of adult neurogenesis [J]. J Neurosci Methods，2002 ......
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