丹参水提取物对小鼠耐缺氧作用的影响(2)
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1.1.3 药品 丹参饮片(新疆参茸中药饮片有限公司，批号：11092704)；红景天胶囊(西藏军区总医院药物研究所，批号：20091119)；氰化钾(上海试剂一厂，批号：820602)；钠石灰(上海五四化学试剂厂，批号：20100112)；95%乙醇(解放军乌鲁木齐总医院药剂科，批号：20100503)。
1.2 方法
1.2.1 丹参水提物的制备 取丹参饮片1 kg，加2倍量的纯化水盖住药材，沸腾后煮2 h，期间加水保持水位，将水煎液倒入大烧杯。药渣加水再煮1 h，倒出液体，两次相加的液体约5 L，过滤，加适量蒸馏水，用95%乙醇调至溶液酒精度为75%，静置12 h，加95%乙醇至溶液酒精度为85%，静置12 h，过滤，用旋转蒸发器回收乙醇，将浓缩液在60℃下烘干，取出，制成粉末备用。
1.2.2 常压密闭缺氧实验[3] 取50只小鼠按体重随机分成5组，每组10只，分别为空白对照组、红景天对照组(阳性对照组)和丹参水提取物低、中、高剂量组。小鼠灌胃给药，给药体积为20.0 mL/kg。空白对照组给予生理盐水，红景天对照组给予相当于生药量的10.0 g/kg，丹参水提取物低、中、高剂量组分别给予相当于生药量的5.0、10.0、20.0 g/kg。连续灌胃10 d，于末次给药后1 h，将各组动物分别放入盛有5 g钠石灰的250 mL磨口广口瓶内(每瓶1只小鼠)，用凡士林封瓶口，盖严，使之不漏气，立即计时，以呼吸停止为指标，记录小鼠存活的时间。
1.2.3 KCN中毒缺氧实验[4] 取50只小鼠按体重随机分成5组，每组10只，实验分组、给药方式和剂量同“1.2.2”项下方法。连续灌胃10 d，于末次给药后1 h，各组动物按体重10 mg/kg腹腔注射KCN溶液后立即记时，空白对照组记录小鼠死亡时间，以呼吸停止为指标。给药组记录小鼠在缺氧状态下的恢复时间，以小鼠昏迷苏醒后，头离地，后肢着地爬行为指标，记录时间。
1.2.4 急性脑缺血性缺氧实验[5] 将50只小鼠按体重随机分成5组，每组10只，实验分组、给药方式和剂量同“1.2.2”项下方法。连续灌胃10 d，于末次给药后1 h，在乙醚浅麻醉下，用粗剪刀双耳连线处快速断，逐只记录小鼠断头后张口喘息的次数。
1.2.5 小鼠血细胞分析 取50只小鼠按体重随机分成5组，每组10只，实验分组、给药方式和剂量同“1.2.2”项下方法。连续灌胃10 d，于末次给药后1 h，摘取小鼠眼球采血，迅速收集1 mL全血放入采血管中，全自动血细胞分析仪测定小鼠外周血液中的红细胞计数(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞平均体积(MCV)以及白细胞计数(WBC)。
1.3 统计学方法
采用SPSS 10.0统计软件进行分析，数据以均数±标准差(x±s)表示，计量资料组间比较采用t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 常压密闭缺氧实验
结果显示，丹参水提取物和红景天可以明显延长小鼠常压密闭缺氧条件下的存活时间，其中中、高剂量组与空白对照组比较，其存活时间差异有高度统计学意义(P < 0.01)，与红景天对照组比较，差异无统计学意义(P > 0.05)，特别是丹参水提取物高剂量组可以延长存活时间达43.3%。见表1。
表1 丹参水提取物对小鼠常压密闭缺氧存活时间的影响
注：与空白对照组比较，**P < 0.01；与红景天对照组比较，△P < 0.05
2.2 KCN中毒缺氧实验
结果显示，空白对照组小鼠注射完KCN溶液后，缺氧反应迅速，小鼠急速窜跳，后肢抽搐蹬直，头部瘫倒在地，全身抽搐，呼吸急促直至死亡。给药组小鼠均无死亡，小鼠给药后，缺氧反应迅速，小鼠急速窜跳，后肢抽搐蹬直，头部瘫倒在地，呼吸急促，一段时间后，小鼠呼吸减缓有咬齿行为，后肢收缩可以爬行，小鼠缺氧状态结束。空白对照组小鼠在5.36 min内全部死亡，提示丹参水提取物和红景天可以显著改善小鼠KCN中毒状况，避免小鼠中毒死亡，中、高剂量组恢复时间与红景天对照组比较，恢复时间差异无统计学意义(P > 0.05)。见表2。
表2 丹参水提取物对小鼠KCN中毒缺氧的影响
注：与红景天对照组比较，△P < 0.05
2.3 急性脑缺血性缺氧实验
结果显示，丹参水提取物和红景天可以明显增加小鼠断头后的呼吸次数，中、高剂量组与空白对照组比较，其呼吸次数差异有高度统计学意义(P < 0.01)，丹参水提取物组与红景天阳性对照组比较，其呼吸次数差异无统计学意义(P > 0.05)，特别是丹参水提取物高剂量组可以增加呼吸次数达45.4%。见表3。
表3 丹参水提取物对小鼠急性脑缺血性缺氧呼吸次数的影响
注：与空白对照组比较，**P < 0.01
2.4 小鼠血细胞分析
结果结果，丹参水提取物组、红景天对照组与空白对照组比较，可以显著提高小鼠外周血中红细胞和血红蛋白的含量(P < 0.05或P < 0.01)，对红细胞平均体积的影响差异无统计学意义(P > 0.05)；丹参水提取物高剂量组和红景天对照组与空白对照组比较，还显著提高了小鼠外周血中白细胞的含量(P < 0.01)。见表4。
3 讨论
丹参的活性成分包括脂溶性成分(主要是丹参酮类)的水溶性成分，在前期的实验中笔者利用醇提水沉法制备了丹参的脂溶性成分，在常压密闭缺氧预实验中脂溶性成分没有延长小鼠的存活时间，这可能与丹参酮类化合物的药理作用有关。丹参的水溶性成分主要包含丹酚酸类化合物。本实验结果显示丹参水提取物可以明显延长小鼠常压密闭缺氧情况下的存活时间，并且可以改善小鼠KCN中毒状况，避免小鼠死亡，具有保护大脑缺血性缺氧作用。丹参水提取物的中、高剂量组在3种缺氧情况下的抗缺氧效果与阳性对照组相当(P > 0.05)。
常压密闭缺氧环境下，由于供氧不足以致细胞内氧分压严重降低，进而导致线粒体用氧障碍并影响能量代谢。氰化钾中毒是由于CN-与线粒体中细胞色素氧化酶中的Fe3+结合生成氰化高铁细胞色素氧化酶，使之不能还原成还原型细胞色素氧化酶，以致呼吸链中断，细胞窒息，造成心、脑等重要器官损伤及中枢神经的破坏[6]。而急性脑缺血性缺氧会造成大脑水肿及能量代谢障碍引起脑死亡。丹参水提取物中的丹酚酸类成分具有很强的抗脂质过氧化和清除自由基作用[7]，可以抑制上述缺氧状况下中性粒细胞释放的氧自由基，并进行有效清除，对脂质过氧化引起的细胞膜损伤有明显的保护作用，可以减少自由基对心肌组织和脑组织造成的损伤。丹参水提取物中的丹参素成分具有改善机体微循环，增加微细血管内血流速度，预防微小血栓的形成，改善细胞缺血缺氧所致的代谢障碍[8]。丹参水提取物中的原儿茶酸和紫酯草B等成分可以减少心肌氧消耗，对于心肌缺血有预防和保护作用，可以恢复缺氧后的心肌收缩力。丹参水溶性成分较多，对心脑血管有较强的药理作用，可能是小鼠抗缺氧作用的关键。本研究血细胞分析显示丹参水提取物可以显著提高小鼠外周血中的红细胞计数及血红蛋白含量 ......
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