短串联重复系列在胎儿性别鉴定中的应用
Y染色体大部分不与X染色体重组，这些非重组区只能由父亲传给儿子。现已发现了一些Y染色体特异短串联重复序列(Y chromosome specific short tandem repeat，简称Y染色体特异STR)，为研究群体亲缘关系提供了新型的遗传标记来源[1-2]。因此，检测孕妇外周血中是否存在某些Y染色体特异重复系列就可能预测胎儿性别，这为胎儿伴性遗传病的风险估计提供可能，为优生优育提高人口质量有重要意义。笔者对20位孕妇及其丈夫外周血浆进行Y染色特异短串联重复系列的检测，将预判结果与产后随访结果比较，旨在探索一种简便可靠的早期胎儿性别鉴定方法。
1 材料与方法
1.1 模板DNA片段提取
从20名孕妇及其丈夫抽取外周血5 mL，EDTA-K2抗凝，4℃低温离心分离血浆，以蔗糖为介质进行密度梯度离心，然后纯化DNA并配成一定浓度范围。
, http://www.100md.com
1.2 实时荧光PCR检测Y染色体特异短串联重复系列
扩增的特异短串联重复系列见表1，引物及探针由美国Promega公司生产提供。总反应体积为25 μL，含有1×PCR缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L KCl)，100 μmol/L dNTP，1.5 mmol/L MgCl2，0.4 μmol/L引物，和5U TaqDNA聚合酶，每个反应里有提取DNA 5 μL，在Gene Amp 9700进行热循环，条件如下：起始变性温度T为 90℃ 10 min，接下来进行30个循环，90℃ 30 s，58℃ 15 min，和72℃ 15 s，最终60℃延伸1 min。每个血浆样本进行测试2次，双蒸水作为空白对照。
2 结果
20例孕妇标本查出有DYS19产物9例，DYS389产物12例，DYS390产物12例，DYS393产物10例，孕妇中扩增到的短串联重复系列在丈夫标本内都检测到。根据检测到其中一种系列者为男性标准，20例孕妇有13例怀男性胎儿，其结果与产后随访完全一致。见表2。
, 百拇医药
3 讨论
目前有200多种伴性遗传病，杜绝或减少遗传病患儿的出生是关系到家庭幸福与社会人口质量的重要问题。对胎儿进行早期性别鉴定，对有患病风险者进行人工终止妊娠是减少此类患儿发生重要手段。目前关于胎儿性别鉴定的方法有多种。它们存在各种各样的缺陷，有的要求妊娠时间过长，实行终止妊娠手术给孕妇带来身体上和精神上负担过大；有的标本取材较难有一定的风险，或实验时间过长不方便患者；有的准确度尚不能达到临床要求。笔者以孕妇和其丈夫外周血浆为标本，采用实时荧光PCR技术进行Y染色体特异重复序列分析，基本克服了以上诸多缺点。
现已有研究发现，母-胎之间存在微量血液交换，母亲体内存在极少的胎儿红细胞和核酸片段，胎儿来源的核酸片段较母亲自身的片段短[3-4]。所以，通过密度梯离心技术可以浓集核酸的同时也可以区分不同来源的核酸，可以得到更纯的胎儿DNA模板。实时荧光PCR技术操作简便，封闭操作污染少，背景干扰小，结果判断客观。Y染色体短串联重复系列只能由父传给儿子，所以本方法特异性好，同时串联重复系列备份多，所以较其他系列更易得到扩增产物，加之测定多个短串联重复序列，使得方法灵敏度较高。以父亲血浆标本扩增结果作为对照，防止亲代不存在所选特异短串联重复系列所致假阴性的可能。本研究结果显示，怀男性胎儿孕妇查出Y染色体短串联重系列数平均为3.31±0.63，4种或任何3种组合短串联重复系列至少检出其中一种的概率为100%(13/13)，即准确度为100%。这说明孕妇外周血中确实存在胎儿核酸片断，以此模板扩增性别决定基因进行胎儿性别鉴定是完全可行。但不同个体检出的系列有微小差别，这可能是因为短串联系列在群体间存在突变[5]，此突变对性别判断的影响可被多重PCR检测多个短串联重复系列所克服。所以，以孕妇外周血血浆为材料，实时荧光PCR技术检测Y染色体短串联重复系列应用于胎儿早期性别鉴定的方法值得探索参考。
(收稿日期：2011-09-16本文编辑：郝明明), http://www.100md.com(龚春红)
1 材料与方法
1.1 模板DNA片段提取
从20名孕妇及其丈夫抽取外周血5 mL，EDTA-K2抗凝，4℃低温离心分离血浆，以蔗糖为介质进行密度梯度离心，然后纯化DNA并配成一定浓度范围。
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1.2 实时荧光PCR检测Y染色体特异短串联重复系列
扩增的特异短串联重复系列见表1，引物及探针由美国Promega公司生产提供。总反应体积为25 μL，含有1×PCR缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L KCl)，100 μmol/L dNTP，1.5 mmol/L MgCl2，0.4 μmol/L引物，和5U TaqDNA聚合酶，每个反应里有提取DNA 5 μL，在Gene Amp 9700进行热循环，条件如下：起始变性温度T为 90℃ 10 min，接下来进行30个循环，90℃ 30 s，58℃ 15 min，和72℃ 15 s，最终60℃延伸1 min。每个血浆样本进行测试2次，双蒸水作为空白对照。
2 结果
20例孕妇标本查出有DYS19产物9例，DYS389产物12例，DYS390产物12例，DYS393产物10例，孕妇中扩增到的短串联重复系列在丈夫标本内都检测到。根据检测到其中一种系列者为男性标准，20例孕妇有13例怀男性胎儿，其结果与产后随访完全一致。见表2。
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3 讨论
目前有200多种伴性遗传病，杜绝或减少遗传病患儿的出生是关系到家庭幸福与社会人口质量的重要问题。对胎儿进行早期性别鉴定，对有患病风险者进行人工终止妊娠是减少此类患儿发生重要手段。目前关于胎儿性别鉴定的方法有多种。它们存在各种各样的缺陷，有的要求妊娠时间过长，实行终止妊娠手术给孕妇带来身体上和精神上负担过大；有的标本取材较难有一定的风险，或实验时间过长不方便患者；有的准确度尚不能达到临床要求。笔者以孕妇和其丈夫外周血浆为标本，采用实时荧光PCR技术进行Y染色体特异重复序列分析，基本克服了以上诸多缺点。
现已有研究发现，母-胎之间存在微量血液交换，母亲体内存在极少的胎儿红细胞和核酸片段，胎儿来源的核酸片段较母亲自身的片段短[3-4]。所以，通过密度梯离心技术可以浓集核酸的同时也可以区分不同来源的核酸，可以得到更纯的胎儿DNA模板。实时荧光PCR技术操作简便，封闭操作污染少，背景干扰小，结果判断客观。Y染色体短串联重复系列只能由父传给儿子，所以本方法特异性好，同时串联重复系列备份多，所以较其他系列更易得到扩增产物，加之测定多个短串联重复序列，使得方法灵敏度较高。以父亲血浆标本扩增结果作为对照，防止亲代不存在所选特异短串联重复系列所致假阴性的可能。本研究结果显示，怀男性胎儿孕妇查出Y染色体短串联重系列数平均为3.31±0.63，4种或任何3种组合短串联重复系列至少检出其中一种的概率为100%(13/13)，即准确度为100%。这说明孕妇外周血中确实存在胎儿核酸片断，以此模板扩增性别决定基因进行胎儿性别鉴定是完全可行。但不同个体检出的系列有微小差别，这可能是因为短串联系列在群体间存在突变[5]，此突变对性别判断的影响可被多重PCR检测多个短串联重复系列所克服。所以，以孕妇外周血血浆为材料，实时荧光PCR技术检测Y染色体短串联重复系列应用于胎儿早期性别鉴定的方法值得探索参考。
(收稿日期：2011-09-16本文编辑：郝明明), http://www.100md.com(龚春红)