大孔吸附树脂纯化黄芩总黄酮工艺研究(2)
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参见附件。
2.2.6 重复性试验 取同一供试品溶液连续测定6次，结果得RSD = 0.37%，表明方法重复性良好。
2.3 大孔吸附树脂的预处理
于95%乙醇浸泡24 h后，湿法装柱，并用95%乙醇动态洗脱5倍树脂体积，水洗至无醇味，依次用5%盐酸(浸泡6 h后，水洗至中性)和5%氢氧化钠(浸泡6 h后，水洗至中性)处理，最后用95%乙醇动态洗脱至流出液加水(体积比1∶5)不变混浊为止，用水置换出乙醇后备用。
2.4 静态吸附
取预处理好的树脂各15 mL，置200 mL容量瓶中，然后分别加入药液50 mL，加水定容，时时振摇24 h，使树脂充分吸附。滤过，滤液适当稀释后，测定溶液中总黄酮的含量，计算静态吸附量。加95%乙醇200 mL于容量瓶中，时时振摇24 h，使树脂充分解吸附。滤过，滤液适当稀释后，测定溶液中总黄酮的含量。计算吸附量、吸附率、解析量和解析率，结果见表1。
吸附量=(上样液中总黄酮的质量浓度×上样液体积-水洗液中总黄酮的质量浓度×水洗液的体积)/树脂的体积
吸附率=(上样液中总黄酮的质量浓度×上样液体积-水洗液中总黄酮的质量浓度×水洗液的体积)/(上样液中总黄酮的质量浓度×上样液体积)×100%
解吸量=95%醇洗液中总黄酮的质量浓度×醇洗液的体积/树脂体积
解吸率=解吸量/吸附量×100%
表1 8种型号树脂对黄芩总黄酮的静态吸附行为
2.5 动态吸附考察
取20 mL不同型号已处理好的树脂分别装入色谱柱，测定死体积后，将一定浓度样品溶液通过树脂柱，以相同的1 BV/h流速进行动态吸附，流出液每10毫升接收一份，每一份取适量，用盐酸-镁粉反应，并辅以TLC薄层检测流出液的黄酮类化合物，待盐酸-镁粉反应呈阳性时，停止上样，记录上样量，用4 BV水洗，收集水洗液定容于1 000 mL量瓶中，测定溶液中总黄酮的含量。再用80%乙醇洗脱，洗至洗液近无色，收集洗脱液于1 000 mL量瓶中，定容，测定溶液中总黄酮的含量。计算吸附量、吸附率、解析量和解析率，结果见表2。
从表1、2可以看出，AB-8、HPD300和XAD-8三种树脂的静态吸附和动态吸附结果好于其他五种树脂，从适用性、生产性及经济性等方面综合考虑，选择AB-8。
2.6 吸附过程参数考察
2.6.1 上样浓度考察 将不同浓度的样品溶液(100、80、60、40 mg/mL)分别通过湿体积为20 mL的AB-8树脂柱，以1 BV/h的流速进行动态吸附。按“2.5”项下“用盐酸-镁粉反应……定容，测定溶液中总黄酮的含量”操作。结果，上样体积分别为80、100、135、200 mL；总黄酮解吸率分别为77.78%、87.40%、87.54%、87.69%。由结果可知，60～80 mg/mL均较合适，考虑到上样体积，选择80 mg/mL。
2.6.2 径高比考察 选择直径不同的色谱柱4根，湿法装入20 mL AB-8树脂使树脂径高比分别达到1∶10、1∶8、1∶6、1∶4，取浓度为80 mg/mL的样品溶液通过树脂柱，以1BV/h的流速进行动态吸附。按“2.5”项下用“盐酸-镁粉反应……定容，测定溶液中总黄酮的含量”操作。结果，上样体积分别为100、95、91、85 mL；总黄酮解吸率分别为91.01%、91.58%、86.67%、77.98%。由结果可知，径高比1∶10～1∶6没有显著性差异，选择1∶8。
2.6.3 吸附流速考察 取浓度为80 mg/mL的样品，通过大孔树脂色谱柱(树脂体积20 mL，径高比1∶8)，分别以1 BV/h、2 BV/h，3 BV/h的流速进行动态吸附。按“2.5”项下“用盐酸-镁粉反应……定容，测定溶液中总黄酮的含量”操作。结果，上样体积分别为100、80、60 mL；总黄酮解吸率分别为91.77%、75.14%、52.70%。由结果可知，流速影响较明显，流速为1 BV/h较好。
2.7 除杂过程各参数考察
2.7.1 除杂体积考察 取浓度为80 mg/mL的样品，通过大孔树脂色谱柱(树脂体积20 mL，径高比1∶8)，分别以1 BV/h的流速进行动态吸附。用盐酸-镁粉反应，并辅以TLC薄层检测黄酮类化合物。待反应呈阳性时，停止上样，水洗除杂，每20毫升接受一份，每一份取适量进行盐酸-镁粉反应(检识黄酮类化合物)和Molish反应(检识糖或糖苷类化合物)，确定最佳洗脱体积。结果为水洗4倍体积最合适。
2.7.2 除杂流速考察 取浓度为80 mg/mL的样品，通过大孔树脂色谱柱(树脂体积20 mL，径高比1∶8)，分别以1 BV/h的流速进行动态吸附。用盐酸-镁粉反应，并辅以TLC薄层检测黄酮类化合物。待反应呈阳性时，停止上样，然后分别用1 BV/h、2 BV/h、3 BV/h水洗除杂，水洗体积为4 BV，收集水洗液，定容于1 000 mL量瓶中，测定溶液中总黄酮的含量。再用80%乙醇洗脱，洗至洗液近无色，收集洗脱液于1 000 mL量瓶中，定容，测定溶液中总黄酮的含量。结果为总黄酮解吸率分别为91.77%、75.14%、52.70%，确定1 BV/h的除杂流速较好。
2.8 洗脱过程各参数考察
2.8.1 洗脱溶剂考察 取浓度为80 mg/mL的样品，通过8根AB-8大孔树脂色谱柱(树脂体积20 mL，径高比1∶8)，分别以1 BV/h的流速进行动态吸附。用盐酸-镁粉反应，并辅以TLC薄层检测流出液的黄酮类化合物。待反应呈阳性时，停止上样，记录上样量，用4 BV水洗，收集水洗液定容于1 000 mL量瓶中，测定溶液中总黄酮的含量。再分别用10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%，醇洗脱至盐酸-镁粉反应呈阴性，收集洗脱液于1 000 mL量瓶中，定容，测定溶液中总黄酮的含量。洗脱液用量分别为950、800、675、500、400、250、200、150 mL；总黄酮解吸率分别为17 ......
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