桑麻合剂提取纯化工艺研究(1)
[摘要] 目的 研究桑麻合剂最佳提取纯化工艺。 方法 以总黄酮含量为指标，采用正交设计法，对料液比、提取时间、提取次数进行优化；采用单因素筛选法，对浓缩液的相对密度和药液含醇量进行优化。 结果 优选的水提取工艺条件为加水提取3次，料液比1∶8，提取1 h，乙醇沉淀工艺条件为浓缩液相对密度为1.05~1.10(60℃)，药液含醇量为70%。 结论 最佳工艺组合试验证实，该组合工艺条件较为可行、可靠。
[关键词] 总黄酮；提取工艺；纯化工艺；正交设计；单因素筛选
[中图分类号] R284.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2012)05(b)-0129-03
桑麻合剂是广东省第二医院研制的医院制剂，由桑白皮、紫菀、甘草等12味药组成，具有清热宣肺、化痰止咳的功效，主要用于风热咳嗽症状。临床上以汤剂煎服，疗效确切。黄酮类成分为方中多味药材的主要药效成分之一[1-2]，因此，本研究选用总黄酮含量和干浸膏得量作为评价指标，采用正交设计法和单因素优选法，分别优选其提取工艺和纯化工艺，以便更好地发挥该制剂的疗效。
, http://www.100md.com
1 仪器与试药
UV22501PC型可见分光光度计(岛津)，Bp211D电子分析天平(德国，sartorius)。芦丁对照品(中国药品生物制品检定所，批号：100080-200306)。桑麻合剂所用药材均由广东广弘药业有限公司购得，经毕晓黎副主任中药师鉴定为正品；所用化学试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 提取工艺优选
2.1.1 正交试验设计
根据预试验结果，选择影响提取因素的料液比、提取时间、提取次数，进行优选，其因素水平设计见表1。
2.1.2 供试品溶液的制备
按处方比例，称取桑白皮、紫菀、甘草等12味药材共9份，每份136.6 g，按正交试验设计表L9(34)安排，分别提取，过滤，滤液分别浓缩并定容至200 mL。测定干浸膏含量和总黄酮含量。
, 百拇医药
2.1.3 干膏含量的测定
精密吸取各样品浓缩液25 mL，置已恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，照干燥失重测定法(《中国药典》2010年版一部附录Ⅸ G)测定，计算干膏得量。
2.1.4 总黄酮含量测定[4]
2.1.4.1 芦丁对照品溶液的制备 精密称取6 mg芦丁，精密称定，加95%乙醇定容至50 mL，得0.12 mg/mL的芦丁标准对照液。
2.1.4.2 测定波长的确定 精密移取芦丁对照溶液10 mL置25 mL容量瓶中， 振荡摇匀后，加入5%亚硝酸钠1 mL，摇匀静置6 min，再加入10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀静置6 min，再加4.3%氢氧化钠10 mL，摇匀后，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀放置15 min，以95%乙醇调零，从400 nm至600 nm进行全波长扫描，测得503 nm处有最大吸收，因此，以503 nm为测定波长。
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2.1.4.3 标准曲线的制备[4] 精密吸取上述对照品溶液2、4、6、8、10 mL至25 mL容量瓶，分别加蒸馏水稀释至10 mL，振荡摇匀后，自“加入5%亚硝酸钠1 mL”起，同测定波长的确定法操作，以试剂作空白，于503 nm下测定吸光值，以吸光度值(A)为纵坐标，芦丁质量浓度(C)为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：C=0.078 5A-0.000 3(r = 0.998 7)。结果表明芦丁对照品在0.009 6~0.096 0 mg/mL呈线性关系。
2.1.4.4 供试品溶液的制备与测定 精密吸取提取液2 mL，加蒸馏水定容至50 mL，摇匀，精密吸取稀释液1 mL，置25 mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至10 mL，按上述方法操作显色，计算总黄酮含量。
2.1.4.5 精密度试验 精密吸取芦丁对照品溶液0.6mL，置10 mL的量瓶中，按上述方法操作显色，平行测定6次，结果 RSD=0.27%，表明精密度良好。
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2.1.4.6 稳定性试验 精密吸取上述供试品溶液0.6 mL，置10 mL的量瓶中，按上述方法操作显色，分别放置0、10、20、30、40、50、60、70、80、90 min，测定各时间点的吸光度，结果RSD=1.79%，表明供试品溶液在90 min内稳定。
2.1.4.7 重复性试验 精密吸取供试品溶液各0.6 mL，置10 mL量瓶中，按上述方法操作显色，测定吸光度，结果RSD=2.31%，表明重复性良好。
2.1.4.8 加样回收率测定 精密称取已知黄酮含量的供试品5份，分别加入芦丁对照品适量，按上述方法操作显色，测定吸光度，计算回收率为98.9%，RSD=0.91%。说明该方法测定结果准确。
2.1.5 数据处理与工艺优选
用综合加权评分法，以干浸膏得量和总黄酮含量的9次试验的最大值为100分，将各指标成分的总量分别转换为评分值，总固体得量的加权系数为0.4，总黄酮含量的加权系数为0.6，将每次试验的各指标成分的评分值乘以相应的加权系数后求和，得综合评分值，以综合评分值计算正交试验结果，并进行方差分析。
结果表明：由直观分析可知因素主次为提取次数(C)>液料比(A)>提取时间(B)。方差分析表明，因素A和因素C对试验结果有显著影响，因素B对试验结果无影响。因此，提取工艺条件定为：处方药材加水提取3次，每次加8倍量水，提取1.0 h，即A2B1C3。
2.1.6 提取工艺验证
按处方比例，称取药材3份，每份136.6 g，按正交试验结果的最佳工艺条件重复试验3次，结果表明：干浸膏得量分别为：34.80、34.51、33.09 g，总黄酮含量为2.254、2.268、2.205 g，平均综合评分值为96.020。与正交试验最大综合评分值接近，提示优选的工艺稳定。, http://www.100md.com(邱建永 王洛临 李智勇 张建军 许曼娇)
[关键词] 总黄酮；提取工艺；纯化工艺；正交设计；单因素筛选
[中图分类号] R284.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2012)05(b)-0129-03
桑麻合剂是广东省第二医院研制的医院制剂，由桑白皮、紫菀、甘草等12味药组成，具有清热宣肺、化痰止咳的功效，主要用于风热咳嗽症状。临床上以汤剂煎服，疗效确切。黄酮类成分为方中多味药材的主要药效成分之一[1-2]，因此，本研究选用总黄酮含量和干浸膏得量作为评价指标，采用正交设计法和单因素优选法，分别优选其提取工艺和纯化工艺，以便更好地发挥该制剂的疗效。
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1 仪器与试药
UV22501PC型可见分光光度计(岛津)，Bp211D电子分析天平(德国，sartorius)。芦丁对照品(中国药品生物制品检定所，批号：100080-200306)。桑麻合剂所用药材均由广东广弘药业有限公司购得，经毕晓黎副主任中药师鉴定为正品；所用化学试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 提取工艺优选
2.1.1 正交试验设计
根据预试验结果，选择影响提取因素的料液比、提取时间、提取次数，进行优选，其因素水平设计见表1。
2.1.2 供试品溶液的制备
按处方比例，称取桑白皮、紫菀、甘草等12味药材共9份，每份136.6 g，按正交试验设计表L9(34)安排，分别提取，过滤，滤液分别浓缩并定容至200 mL。测定干浸膏含量和总黄酮含量。
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2.1.3 干膏含量的测定
精密吸取各样品浓缩液25 mL，置已恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，照干燥失重测定法(《中国药典》2010年版一部附录Ⅸ G)测定，计算干膏得量。
2.1.4 总黄酮含量测定[4]
2.1.4.1 芦丁对照品溶液的制备 精密称取6 mg芦丁，精密称定，加95%乙醇定容至50 mL，得0.12 mg/mL的芦丁标准对照液。
2.1.4.2 测定波长的确定 精密移取芦丁对照溶液10 mL置25 mL容量瓶中， 振荡摇匀后，加入5%亚硝酸钠1 mL，摇匀静置6 min，再加入10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀静置6 min，再加4.3%氢氧化钠10 mL，摇匀后，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀放置15 min，以95%乙醇调零，从400 nm至600 nm进行全波长扫描，测得503 nm处有最大吸收，因此，以503 nm为测定波长。
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2.1.4.3 标准曲线的制备[4] 精密吸取上述对照品溶液2、4、6、8、10 mL至25 mL容量瓶，分别加蒸馏水稀释至10 mL，振荡摇匀后，自“加入5%亚硝酸钠1 mL”起，同测定波长的确定法操作，以试剂作空白，于503 nm下测定吸光值，以吸光度值(A)为纵坐标，芦丁质量浓度(C)为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：C=0.078 5A-0.000 3(r = 0.998 7)。结果表明芦丁对照品在0.009 6~0.096 0 mg/mL呈线性关系。
2.1.4.4 供试品溶液的制备与测定 精密吸取提取液2 mL，加蒸馏水定容至50 mL，摇匀，精密吸取稀释液1 mL，置25 mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至10 mL，按上述方法操作显色，计算总黄酮含量。
2.1.4.5 精密度试验 精密吸取芦丁对照品溶液0.6mL，置10 mL的量瓶中，按上述方法操作显色，平行测定6次，结果 RSD=0.27%，表明精密度良好。
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2.1.4.6 稳定性试验 精密吸取上述供试品溶液0.6 mL，置10 mL的量瓶中，按上述方法操作显色，分别放置0、10、20、30、40、50、60、70、80、90 min，测定各时间点的吸光度，结果RSD=1.79%，表明供试品溶液在90 min内稳定。
2.1.4.7 重复性试验 精密吸取供试品溶液各0.6 mL，置10 mL量瓶中，按上述方法操作显色，测定吸光度，结果RSD=2.31%，表明重复性良好。
2.1.4.8 加样回收率测定 精密称取已知黄酮含量的供试品5份，分别加入芦丁对照品适量，按上述方法操作显色，测定吸光度，计算回收率为98.9%，RSD=0.91%。说明该方法测定结果准确。
2.1.5 数据处理与工艺优选
用综合加权评分法，以干浸膏得量和总黄酮含量的9次试验的最大值为100分，将各指标成分的总量分别转换为评分值，总固体得量的加权系数为0.4，总黄酮含量的加权系数为0.6，将每次试验的各指标成分的评分值乘以相应的加权系数后求和，得综合评分值，以综合评分值计算正交试验结果，并进行方差分析。
结果表明：由直观分析可知因素主次为提取次数(C)>液料比(A)>提取时间(B)。方差分析表明，因素A和因素C对试验结果有显著影响，因素B对试验结果无影响。因此，提取工艺条件定为：处方药材加水提取3次，每次加8倍量水，提取1.0 h，即A2B1C3。
2.1.6 提取工艺验证
按处方比例，称取药材3份，每份136.6 g，按正交试验结果的最佳工艺条件重复试验3次，结果表明：干浸膏得量分别为：34.80、34.51、33.09 g，总黄酮含量为2.254、2.268、2.205 g，平均综合评分值为96.020。与正交试验最大综合评分值接近，提示优选的工艺稳定。, http://www.100md.com(邱建永 王洛临 李智勇 张建军 许曼娇)