苦参碱对肺纤维化大鼠核因子E2相关因子2、血红素氧合酶-1的作用研究影响(3)
2 结果
2.1 病理观察
C组大鼠肺泡无炎性细胞浸润，结构正常。M组第7天为肺泡腔、肺间质内有大量的多核及单核细胞浸润，炎性肉芽组织破坏了正常结构。第14天时，胶原沉积，斑片状纤维化；第28天肺泡炎症稍有减轻，但病变范围弥散，肺泡结构破坏。M50组、M100组、P组与M组病理变化规律相似，但程度都较M组轻微。
2.2 大鼠肺组织蛋白表达
大鼠肺组织Nrf2、HO-1表达结果见图1、2。定量分析显示在M、P、M50、M100组造模后的几次取材中，Nrf2、HO-1表达均高于C组(P < 0.05)。第7、14天P组、M50组、M100组的Nrf2、HO-1表达比M组高(P < 0.05)；P组与M50组比较差异无统计学意义(P > 0.05)；第28天Nrf2、HO-1表达在M、P、M50、M100组明显低于第7天(P < 0.05)。
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图1 各组大鼠肺组织Nrf2蛋白表达的动态变化
2.3 大鼠肺组织匀浆mRNA表达
M、P、M50、M100组造模后Nrf2、HO-1 mRNA表达均显著强于C组(P < 0.05)。第7、14天时P组、M50组、M100组表达强于M组(P < 0.05)；M100组表达量高于P、M50组(P < 0.05)。第28天时M组、P组、M50组、M100组组间比较差异无统计学意义(P > 0.05)；但较第7天表达显著变弱(P < 0.05)。见表2、3。
表2 各组大鼠肺组织Nrf2mRNA表达的动态变化(x±s)
注：与正常对照组比较，aP < 0.05；与模型组比较，bP < 0.05；与泼尼松处理组比较，cP < 0.05；与苦参碱100处理组比较，dP < 0.05；与本组第7天比较，eP < 0.05
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表3 各组大鼠肺组织HO-1mRNA表达的动态变化(x±s)
注：与正常对照组比较，aP < 0.05；与模型组比较，bP < 0.05；与泼尼松处理组比较，cP < 0.05；与苦参碱100处理组比较，dP < 0.05；与本组第7天比较，eP < 0.05
经直线相关分析，结果显示Nrf2蛋白/mRNA表达与HO-1蛋白/mRNA表达均呈正相关(P < 0.05)。
3 讨论
3.1 大鼠肺纤维化动物模型的评价
博来霉素是一组多肽类抗肿瘤抗生素，可引起肺纤维化，其公认机制为在氧分子和亚铁离子存在下，博来霉素产生活性氧(ROS)，引起肺纤维化，目前已用作研究肺纤维化的经典模型[7]。实验结果HE染色示模型组第28天大量肺泡结构萎陷，肺泡间隔及部分肺泡腔被胶原和纤维蛋白占据，证明肺纤维化造模成功。
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3.2 大鼠肺组织中Nrf2、HO-1基因表达的动态变化
Nrf2在抗氧化剂应激元件(ARE)介导的抗氧化基因表达中起重要的作用，在细胞氧化应激时，Nrf2可能进入细胞核与ARE结合，导致下游GSTs、谷氨酸-半胱氨酸连接酶、HO-1和硫氧还蛋白基因的转录活化。HO-1为一种热休克蛋白，为诱导型血红素氧合酶，对大鼠肺组织纤维化有保护性作用[8]，其机制是多种因素容易将HO-1时HO的诱导形式影响，诱导肺HO-1 mRNA的转录，引起肺HO-1蛋白合成和活性增加，肺组织HO-1合成增加并释放，使得外周HO-1活性增强。另外还可能激活了缺氧诱导因子(HIF-1)，HO-1基因163-pb片段上的位点与HIF-1结合，调节HO-1mRNA基因转录[9]；氧化反应导致的体内氧自由基增多，炎性细胞因子的分泌增加，酸中毒导致的游离钙增加均可直接诱导HO-1的表达[10]。
本文结果显示，博来霉素诱导的肺纤维化模型中，Nrf2、HO-1在模型组表达较正常对照组增高(P < 0.05)，且表达量从第7天后就逐步减低，第28天表达最低峰，但仍高于正常对照组。这是由于博来霉素气管内注入后大鼠肺组织第7天处于炎症及氧化应激高峰期，机体产生应激反应，诱导Nrf2的表达，产生下游HO-1等抗氧化物质来对抗炎症反应，从而保护机体免受损伤。在28天时，肺纤维化已经基本形成，氧化应激因素已经比较轻，因此表达最低。干预组与模型组变化趋势一致，但Nrf2、HO-1表达显著高于模型组和正常对照组。这表明通过提高抗氧化转录因子Nrf2及其靶基因之一的HO-1表达可以保护肺组织，减轻肺纤维化程度。而模型组中抗氧化基因Nrf2及HO-1表达增加，却仍然无法阻止肺纤维化的进展，考虑可能因素肺纤维化形成过程早期主要是启动炎症及免疫反应，同时启动了氧化应激反应，使机体处于氧化和抗氧化失平衡状态。
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3.3 苦参碱对大鼠肺纤维化的干预作用
本文结果显示苦参碱[100 mg/(kg·d)]能显著减轻大鼠肺组织肺泡炎的程度，但仍较正常对照组重。苦参碱有一定的抗炎作用，但低剂量[50 mg/(kg·d)]苦参碱在减轻肺泡炎程度上与泼尼松处理组比较统计学差异不明显；苦参碱在剂量较大时[100 mg/(kg·d)]，其抗炎作用较泼尼松处理组强。推测苦参碱可能主要通过抑制炎性细胞(如巨噬细胞等)、减少炎性介质的产生来减轻炎症程度。苦参碱100处理组肺组织中Nrf2、HO-1表达明显较其他组在第7、14天增多，具体机制可能与氧化应激时抗氧化有关，如通过Nrf2的高表达来调控HO-1等下游抗氧化物质。泼尼松龙的干预作用与低剂量苦参碱作用相似，二者之间无统计学差异，这表明苦参碱100处理组可能是通过诱导Nrf2的高表达来促使下游抗氧化物质如HO-1的大量生成，从而在纤维化早期及炎症期抑制肺纤维化的发展。
苦参碱有抑制博来霉素诱导的大鼠肺纤维化作用，其机制可能与早期上调Nrf2、HO-1表达调节抗氧化应激有关。苦参碱有望成为临床治疗肺间质性疾病的一类新药。
[参考文献]
[1] Eric SW，Michael H，Victor J. Thannickal pathogenetic mechanisms in usual interstitial pneumonia/idiopathic pulmonaryfibrosis [J]. J Pathol，2003，201：343-354., http://www.100md.com(罗庆凯 陈伟 何振华 等)
2.1 病理观察
C组大鼠肺泡无炎性细胞浸润，结构正常。M组第7天为肺泡腔、肺间质内有大量的多核及单核细胞浸润，炎性肉芽组织破坏了正常结构。第14天时，胶原沉积，斑片状纤维化；第28天肺泡炎症稍有减轻，但病变范围弥散，肺泡结构破坏。M50组、M100组、P组与M组病理变化规律相似，但程度都较M组轻微。
2.2 大鼠肺组织蛋白表达
大鼠肺组织Nrf2、HO-1表达结果见图1、2。定量分析显示在M、P、M50、M100组造模后的几次取材中，Nrf2、HO-1表达均高于C组(P < 0.05)。第7、14天P组、M50组、M100组的Nrf2、HO-1表达比M组高(P < 0.05)；P组与M50组比较差异无统计学意义(P > 0.05)；第28天Nrf2、HO-1表达在M、P、M50、M100组明显低于第7天(P < 0.05)。
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图1 各组大鼠肺组织Nrf2蛋白表达的动态变化
2.3 大鼠肺组织匀浆mRNA表达
M、P、M50、M100组造模后Nrf2、HO-1 mRNA表达均显著强于C组(P < 0.05)。第7、14天时P组、M50组、M100组表达强于M组(P < 0.05)；M100组表达量高于P、M50组(P < 0.05)。第28天时M组、P组、M50组、M100组组间比较差异无统计学意义(P > 0.05)；但较第7天表达显著变弱(P < 0.05)。见表2、3。
表2 各组大鼠肺组织Nrf2mRNA表达的动态变化(x±s)
注：与正常对照组比较，aP < 0.05；与模型组比较，bP < 0.05；与泼尼松处理组比较，cP < 0.05；与苦参碱100处理组比较，dP < 0.05；与本组第7天比较，eP < 0.05
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表3 各组大鼠肺组织HO-1mRNA表达的动态变化(x±s)
注：与正常对照组比较，aP < 0.05；与模型组比较，bP < 0.05；与泼尼松处理组比较，cP < 0.05；与苦参碱100处理组比较，dP < 0.05；与本组第7天比较，eP < 0.05
经直线相关分析，结果显示Nrf2蛋白/mRNA表达与HO-1蛋白/mRNA表达均呈正相关(P < 0.05)。
3 讨论
3.1 大鼠肺纤维化动物模型的评价
博来霉素是一组多肽类抗肿瘤抗生素，可引起肺纤维化，其公认机制为在氧分子和亚铁离子存在下，博来霉素产生活性氧(ROS)，引起肺纤维化，目前已用作研究肺纤维化的经典模型[7]。实验结果HE染色示模型组第28天大量肺泡结构萎陷，肺泡间隔及部分肺泡腔被胶原和纤维蛋白占据，证明肺纤维化造模成功。
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3.2 大鼠肺组织中Nrf2、HO-1基因表达的动态变化
Nrf2在抗氧化剂应激元件(ARE)介导的抗氧化基因表达中起重要的作用，在细胞氧化应激时，Nrf2可能进入细胞核与ARE结合，导致下游GSTs、谷氨酸-半胱氨酸连接酶、HO-1和硫氧还蛋白基因的转录活化。HO-1为一种热休克蛋白，为诱导型血红素氧合酶，对大鼠肺组织纤维化有保护性作用[8]，其机制是多种因素容易将HO-1时HO的诱导形式影响，诱导肺HO-1 mRNA的转录，引起肺HO-1蛋白合成和活性增加，肺组织HO-1合成增加并释放，使得外周HO-1活性增强。另外还可能激活了缺氧诱导因子(HIF-1)，HO-1基因163-pb片段上的位点与HIF-1结合，调节HO-1mRNA基因转录[9]；氧化反应导致的体内氧自由基增多，炎性细胞因子的分泌增加，酸中毒导致的游离钙增加均可直接诱导HO-1的表达[10]。
本文结果显示，博来霉素诱导的肺纤维化模型中，Nrf2、HO-1在模型组表达较正常对照组增高(P < 0.05)，且表达量从第7天后就逐步减低，第28天表达最低峰，但仍高于正常对照组。这是由于博来霉素气管内注入后大鼠肺组织第7天处于炎症及氧化应激高峰期，机体产生应激反应，诱导Nrf2的表达，产生下游HO-1等抗氧化物质来对抗炎症反应，从而保护机体免受损伤。在28天时，肺纤维化已经基本形成，氧化应激因素已经比较轻，因此表达最低。干预组与模型组变化趋势一致，但Nrf2、HO-1表达显著高于模型组和正常对照组。这表明通过提高抗氧化转录因子Nrf2及其靶基因之一的HO-1表达可以保护肺组织，减轻肺纤维化程度。而模型组中抗氧化基因Nrf2及HO-1表达增加，却仍然无法阻止肺纤维化的进展，考虑可能因素肺纤维化形成过程早期主要是启动炎症及免疫反应，同时启动了氧化应激反应，使机体处于氧化和抗氧化失平衡状态。
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3.3 苦参碱对大鼠肺纤维化的干预作用
本文结果显示苦参碱[100 mg/(kg·d)]能显著减轻大鼠肺组织肺泡炎的程度，但仍较正常对照组重。苦参碱有一定的抗炎作用，但低剂量[50 mg/(kg·d)]苦参碱在减轻肺泡炎程度上与泼尼松处理组比较统计学差异不明显；苦参碱在剂量较大时[100 mg/(kg·d)]，其抗炎作用较泼尼松处理组强。推测苦参碱可能主要通过抑制炎性细胞(如巨噬细胞等)、减少炎性介质的产生来减轻炎症程度。苦参碱100处理组肺组织中Nrf2、HO-1表达明显较其他组在第7、14天增多，具体机制可能与氧化应激时抗氧化有关，如通过Nrf2的高表达来调控HO-1等下游抗氧化物质。泼尼松龙的干预作用与低剂量苦参碱作用相似，二者之间无统计学差异，这表明苦参碱100处理组可能是通过诱导Nrf2的高表达来促使下游抗氧化物质如HO-1的大量生成，从而在纤维化早期及炎症期抑制肺纤维化的发展。
苦参碱有抑制博来霉素诱导的大鼠肺纤维化作用，其机制可能与早期上调Nrf2、HO-1表达调节抗氧化应激有关。苦参碱有望成为临床治疗肺间质性疾病的一类新药。
[参考文献]
[1] Eric SW，Michael H，Victor J. Thannickal pathogenetic mechanisms in usual interstitial pneumonia/idiopathic pulmonaryfibrosis [J]. J Pathol，2003，201：343-354., http://www.100md.com(罗庆凯 陈伟 何振华 等)