诊断慢性粒细胞白血病的电化学生物传感器的研究(2)
 |
| 第1页 |
参见附件。
根据ssDNA适体的序列选择各适体上、下游引物经PCR扩增成5'端标记巯基和生物素的双链DNA。用生物素-链霉亲和素磁珠的方法分离，获得5'端标记巯基适体。
1.2.3 在磁性纳米粒子上固定标记氨基的核酸适体Ⅰ
将50 μL的带羧基的磁性纳米粒子用PBS缓冲溶液(pH=7.3)洗涤5次(500 μL/次)、5'端标记氨基的核酸适体40 μL，加入5 mg咪唑，超声30 min，室温下放置12 h。利用磁铁分离，分3次用600 μL PBS溶液洗涤沉淀，洗去过量的核酸适配体Ⅰ，将最终的沉淀(纳米粒子上固定有核酸适体Ⅰ)分散在500 μL PBS缓冲溶液中，4℃冷藏[11]。
1.2.4 巯基标记核酸适体Ⅱ金胶探针的制备
1.2.4.1 金胶溶液的制备 参照文献[2]制备金胶溶液：所用器皿均用王水浸泡过夜，用三蒸水冲洗。将HAuCl4配制成0.01%水溶液，将1.1 mg HAuCl4溶于11 mL三蒸水，过0.22 μm的滤膜。将柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)配制成1%水溶液，将0.1 g柠檬酸三钠溶于10 mL三蒸水，过0.22 μm的滤膜。取10 mL 0.01% HAuCl4煮沸，边搅动边准确加入250 μL的1%柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)水溶液。在沸腾状态搅拌15～30 min。不加热情况下再搅拌10 min。冷却至室温，用蒸馏水定容至原体积。置于棕色瓶内4℃保存，数月有效[12]。
1.2.4.2 巯基标记核酸适体Ⅱ金胶探针制备结合比例的确定 用3 mL的金胶溶液溶解30、40、50 μL的巯基标记核酸适体Ⅱ，室温静置24 h，让核酸适配体Ⅱ中的巯基与金胶充分结合，然后将此溶液在15 000 r/min条件下，离心25 min，分离后收集上清液。用500 μL 0.1 mol/L PBS缓冲溶液(pH=7.3)冲洗沉淀物3次，反复离心，收集上清液(除去过量的核酸适体)，合并上清液，在260 nm处测定吸光度(图1)。
50 μL表示溶液中含核酸适体50 μL；40 μL表示溶液中含核酸适体
40 μL；30 μL表示溶液中含核酸适体30 μL
图1 不同金胶探针溶液的吸光度
由图1可知，用40、50 μL含巯基的核酸适体与3 mL金胶溶液制备的金胶探针，在260 nm处有吸光度、用30 μL含巯基的核酸适体与3 mL金胶溶液制备的金胶探针，在260 nm处无明显吸光度，说明40 μL以上比例的巯基标记核酸适体溶解于3 mL的金胶溶液制备金胶探针时，可确保巯基标记核酸适体Ⅱ过量。
1.2.4.3 巯基标记核酸适体Ⅱ金胶探针的制备 用3 mL的金胶溶液溶解40 μL的巯基标记核酸适体Ⅱ用上述方法制备金胶探针，将离心后的沉淀，加入500 μL 0.1 mol/L PBS缓冲溶液(pH=7.3)稀释成一定浓度，4℃低温冷藏。
1.2.5 CMLK562的特异性识别与分离
用含10%小牛血清的RPMI-1640的培养液，培养细胞。调整细胞计数浓度为5×105/mL左右，20 pmoL的纳米粒子上固定有核酸适体Ⅰ悬浮液[9]，将10 μL的PBS(1.5 mmol/L，pH=7.4)溶液和20 pmoL核酸适体Ⅱ的金胶探针置于自制的反应池中，加入20 μL的K562细胞溶液，在室温下识别结合20 min。K562细胞与核酸适配体Ⅰ和Ⅱ特异性结合形成含有磁性颗粒和纳米金的复合结构结构。然后，把电极放在一块磁铁上，将上述液体滴加在工作电极上，待三明治结构吸附在工作电极后，1～2 min，吸弃溶液，在磁场作用下，用PBS缓冲溶液冲洗几次，分离沉淀，除去未结合的多余的适体或细胞液[14]。最后含复合结构的磁性颗粒吸附在电极表面待测定电流。
1.2.6 检测电化学
1.2.6.1 两种纳米粒子标记的核酸适体两两组合后最佳配对的筛选 将吸有复合结构的磁性颗粒的电极放于磁铁，将0.1 mol/L盐酸溶液20 μL滴加在工作电极上，注意液滴覆盖工作电极、参比电极和辅助电极。用+1.25 V恒电位预氧化150 s，使金胶探针中的金原子氧化成Au3+离子，立即进行反向阴极扫描，获得Au3+电化学还原的差分脉冲伏安(DPSV)曲线[15]。从此图可知金胶探针的特征电化学还原峰在+0.45 V(vs. Ag/AgCl)，有两组适体的配对产生的电流非常明显，证明此组为最佳组合(P2-S3-P1-S5)。
1.2.6.2 适体检测方法灵敏度及检测限的测定 将筛选出的最佳组合的适体组(P2-S3-P1-S5)，分别取20 pmoL按照上述实验方法1.2.5和1.2.6，分别检测不同数量的K562细胞。见图2。
图2 检测细胞数目与DPV电流值的拟合曲线
图2以细胞数目为横坐标 ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(3483kb)。