惠州客家人群食管癌EGFR蛋白表达及与MAPK信号通路相关性的初步研究(2)
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研究表明，食管癌发病表现为一定的地域分布。河南林州市，广东省潮汕地区和梅州地区(客家人为主)为食管癌高发区。本课题组前期研究发现，惠州地区客家人群食管癌与PTEN/STAT1/3信号传导密切相关[1]，但信号传导通路极为复杂，是否EGFR/MAPK信号传导在惠州客家人群食管癌的发生发展过程中起重要作用，需要进一步探讨。表皮生长因子受体EGFR(epidermal growth factor receptor)属于细胞表面酪氨酸激酶受体erbB家族成员，在多种肿瘤如食管癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌、子宫内膜癌中表达或高表达，并且EGFR高表达是肿瘤患者预后差的一个重要指标[2]。研究表明，EGFR配体有TGF-α、EGF、Epiregulin、β-cellulin等，配体与EGFR结合引起erbB家族成员内部同二聚体或异二聚体受体复合物形成，胞质区便自我磷酸化，启动相应的信号传导通路。受体复合物自我磷酸化可以激活几条潜在的EGFR信号传导通路，包括：Ras/MAPK、PI3K、PLC-γ和STAT四条主要的传导通路[3-4]。
有丝分裂原激活蛋白激酶/细胞外信号调节激酶MAPK/ERKs(mitogenaetivated protein kinases/extracellular regulated kinases)信号传导通路异常在食管癌增殖过度与凋亡受阻中起重要作用。ERKs可被多种丝裂原信号和癌基因产物激活，转导信号至细胞及其核内，诱导细胞增殖和分化。Ras/MAPK通路是EGFR活化的一条重要信号转导通路，ERK1/2一旦活化，便从胞质进入胞核，磷酸化和活化核内的效应分子，最终启动与细胞增殖有关的靶基因的转录。研究表明，EGFR既介导促进细胞代谢、增殖、迁移，促进血管发生，抑制细胞凋亡的信号转导通路的活化，又介导抑制细胞生长、促进凋亡的信号转导通路的活化[5]。本研究检测53例惠州客家人群食管癌EGFR蛋白及MAPK(ERK1/2)蛋白的表达，初步探讨EGFR蛋白及MAPK(ERK1/2)与惠州客家人群食管癌发生发展的关系及其可能的与MAPK(ERK1/2)信号传导相关的机制。
1 材料与方法
1.1 标本来源
53例食管鳞癌标本取自2004年1月～2008年12月惠州市中心人民医院的食管癌患者53例(三代以内为惠州本地客家人，术前均未经放疗和化疗)。根据2006年WHO组织学新分类进行分类，其中Ⅰ级13例，Ⅱ级19例，Ⅲ级21例；有淋巴结转移21例，无淋巴结转移32例；侵及浅层(黏膜下层或浅肌层)29例，侵及深层24例。同时取上述患者癌旁切缘组织作为对照组。
1.2 主要试剂
兔源Anti-EGFR(1005)(Santa Cruz公司，美国)，兔源Anti-MAPK(ERK1/2)及鼠源Anti-p-ERK1/2(SIGMA公司，美国)，SP试剂盒(北京中山生物公司，中国)。
1.3 免疫组化染色
石蜡切片常规脱蜡至水，3% H2O2室温10 min，微波修复抗原后，滴加一抗：兔抗人EGFR(1∶200)；兔抗人MAPK(ERK1/2)(1∶500)；鼠抗p-ERK1/2(1∶500)；均4℃过夜。次日滴加羊抗兔/鼠二抗，37℃ 30 min；DAB显色，苏木精复染，脱水透明，封片。以PBS替代一抗作阴性对照。以含10%小牛血清1640培养的Hela细胞作为指标的阳性对照。采用HPIAS-1000高清晰度病理图文分析系统，随机观察染色清晰的10个高倍视野共计数1 000个癌细胞阳性的百分比，将阳性细胞所占百分比打分：0分为阴性，1分为<10%，2分为10%～50%，3分为51%～75%，4分为>75%。同时染色强度进行打分：0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。以两者乘积为最后得分：0分为阴性(-)，1～2分为弱阳性(+)，>3分为阳性(++)。
1.4 Western blot免疫印迹法检测蛋白表达
新鲜组织尽量剪碎(其中癌组织取实体瘤中心组织，癌旁正常组织仅取黏膜层)，4℃ PBS冲洗，加入适量4℃ TritonX-100提取液以电动匀浆器匀浆(速度为11 000 r/min)，其中癌组织匀浆1.5 min，癌旁正常黏膜匀浆4 min，玻璃匀浆器匀浆，每个组织匀浆20次再以超声波破碎细胞(每个标本240次，频率为间隔2 s，超声2 s，功率为300 W)；10 000 r/min 4℃离心5 min，取上清分装后冻存于-80℃备用。用Bradford法测定蛋白浓度。取100 μg蛋白点样于10% SDS-PAGE，电泳分离蛋白质，电印迹半干转移法转至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉TBST溶液4℃冰箱封闭过夜，分别用一抗(EGFR工作效价1∶500；ERK1/2工作效价1∶1000、p-ERK1/2工作效价1∶1000稀释)与二抗孵育，DAB显色或洗膜后ECL发光显影，定影。硝酸纤维素膜经过洗脱去除二抗和一抗后，用β-actin抗体(作为内参)按上述同样方法检测。最后对胶片进行扫描，用Bio-Rad Quantity one软件分析测定其区带的灰度，并计算出与actin条带灰度值的比值。
1.5 统计学方法
应用SPSS 11 ......
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