幽门螺杆菌对食管癌COXⅠ表达的影响(1)
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[摘要] 目的 观察幽门螺杆菌(H. pylori，Hp)作用于食管癌细胞后细胞色素氧化酶Ⅰ(cytochrome oxidaseⅠ，COXⅠ)mRNA及其蛋白表达的变化，探讨Hp在肿瘤发生发展中可能的作用机制。 方法 将Hp与食管癌细胞分别作用4、8、24 h，收集细胞，应用Real-Time PCR和Western blot法检测各时间点COXⅠmRNA及其蛋白表达。 结果 Hp与食管癌细胞共培养4、8、24 h后，COXⅠmRNA表达量逐渐减少，4 h的表达量显著低于对照组，其后下降速度减慢，24 h后表达量不再有明显改变。COXⅠ蛋白表达呈现相似的趋势。 结论 Hp与食管癌细胞共培养后，可导致线粒体编码基因COXⅠmRNA及其蛋白表达障碍，从而影响线粒体功能。
[关键词] 幽门螺杆菌；食管癌上皮细胞；线粒体；细胞色素氧化酶Ⅰ
[中图分类号] R735.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2012)10(a)-0008-03
自从幽门螺杆菌(Hp)被分离培养成功以来，其与消化系统疾病的关系已引起国内外学者的广泛关注。Hp在体内长期定植可以造成上皮细胞直接损伤，最终导致消化性溃疡和肿瘤的发生[1-2]。Hp已被WHO宣布为Ⅰ类致癌因子[3]，但其致病机制并不明了。现有报道称Hp的空泡细胞毒素(vacuolating cytotoxin，VacA)可通过线粒体途径诱导细胞凋亡[4-5]。Hp感染可引起线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)片段与核基因组的整合，并参与胃癌的发生[6-8]。既往的研究提示线粒体途径在Hp的致癌机制中占有重要作用，为了进一步明确这一问题，笔者观察了Hp对线粒体编码基因细胞色素氧化酶Ⅰ(COXⅠ)mRNA 表达的影响，希望能较深入地探讨线粒体损伤在Hp致癌中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
食管癌细胞株ECa-109购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，Hp(NCTC11637)菌种由浙江大学严杰教授赠送；RMPI 1640、小牛血清购自GIBCO；Hp添加剂(SR0147)、哥伦比亚血琼脂、厌氧袋、微需氧产气袋均购自英国Oxoid；Trizol试剂、抗小鼠IgG-HRP购自Sigma公司；逆转录试剂盒(DRR036A)、Real-Time PCR试剂盒(DRR041A)均购自日本TaKaRa公司；COX-Ⅰ单克隆抗体购自Mitosciences公司；RIPA细胞裂解缓液购自上海申能博彩。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 ECa-109在含10%灭活小牛血清，100 μ/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RMPI1640培养基中，置于37℃、5%CO2的培养箱中完全培养，细胞2 d换液，85%汇片时传代。
1.2.2 细菌培养 将Hp接种于含5%脱纤维羊血和Hp添加剂的哥伦比亚血琼脂平皿上，立即置厌氧袋中，并加入微需氧产气袋，于37℃培养箱中培养，3～5 d后观察结果，经肉眼观察菌落形态、革兰染色和尿素酶试验等生化实验证实为Hp。用含10%小牛血清的无抗生素RMPI 1640培养液制成细菌悬液，分光光度计上测定细菌浓度。
1.2.3 细菌细胞共培养 将ECa-109细胞以3×105的密度接种于6孔细胞培养板，于37℃、5% CO2的培养箱中培养24 h，实验组换上Hp细菌悬液，放于细胞培养箱共同培养中，混合后使细菌/细胞比例为100∶1，分别培养4、8、24 h。对照组换上含10%小牛血清的无抗生素RMPI 1640培养液。
1.2.4 Real-Time PCR反应引物 根据GenBank 中的人线粒体基因组序列(NC_012920)应用 Beacon Desinger 7.9设计COX-Ⅰ引物，由上海捷瑞生物有限公司合成。PCR引物序列为，COX-Ⅰ：5′-CTGACTGGCATTGTATTAG-3′， 5′-ATTGATAGGACATAGTGGAA-3′；内参GAPDH：5′-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3′，5′-GGTGGAATC ATATTGGAACA-3′。
1.2.5 Real-Time PCR反应体系、条件及mRNA表达量的计算 Trizol试剂抽提细胞总RNA。逆转录用的是日本TaKaRa 公司的PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time试剂盒(DRR036A) ......
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