复方松及片提取物对博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化的影响(1)
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[摘要] 目的 观察复方松及片(CFRB)对博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化的影响，初步探究复方松及片对肺纤维化的作用及其机制。 方法 采用气道滴入博莱霉素(2.5 mg/kg)制备肺纤维化模型，在造模后每日采用灌胃方式给予复方松及片提取物，对照组腹腔注射地塞米松。连续用药14 d后，采用生理盐水进行支气管肺泡灌洗(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，收集BALF，ELISA法测定转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的含量。液氮速冻肺组织，-80℃保存，检测各组肺组织羟脯氨酸含量，以及PDE8A mRNA的表达。 结果 复方松及片提取物对博莱霉素气道滴入诱导的肺纤维化变化有一定的抑制作用，能改善肺组织的纤维化病理改变。复方松及片提取物能明显降低BALF中TGF-β的含量，且对磷酸二酯酶8A(PDE8A)的mRNA表达也有一定的抑制作用。 结论 复方松及片对博莱霉素诱导的肺纤维化有一定作用，提示复方松及片可能用于肺纤维化的治疗，同时PDE8A可能是肺纤维化的新靶点。
[关键词] 复方松及片；肺纤维化；博莱霉素；磷酸二酯酶8A
[中图分类号] R332 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2012)10(a)-0024-04
特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一种原因不明、与年龄相关的破坏性肺部疾病，以弥漫性肺泡炎和肺泡结构紊乱导致肺间质纤维化为特征，通常这种实质病变具有不可逆性及严重的致死率[1]。目前尚无有效的治疗手段来阻止或逆转纤维化的过程，因此寻找可以在上皮损伤过度修复过程中发挥作用的药物，成为探索终止和逆转肺纤维化过程的关键。
复方松芨片(Compound Formula Rosin and Bletilla Table，CFRB)的主要成分是白及(Bletillae Rhizoma)、沙参(Fourleaf Ladybell Root，Radix Adenophorae)、百部(Stemona Root，Radix Stemonae)等，这些成分均归肺经，具清肺、化痰、止咳、扶正抗痨、止血生肌等功能，临床上主要用于各型结核病出血、慢性咳喘及慢性胃肠疾病等，临床效果显著。有文献报道白及对矽肺肺部症状有改善作用[2]，而沙参对博莱霉素诱导的肺纤维化有改善作用[3-5]，但作用尚不清楚。本研究采用博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠模型，研究CFRB对肺纤维化病理改变的影响，进一步检测代表性的炎症因子如TGF-β1的分泌，肺组织中羟脯氨酸的含量等，并从mRNA表达水平进行了相关机制研究，为临床治疗肺纤维化提供新途径，为老药新用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物、药品、试剂和仪器
ICR小鼠，雄性，8周，体重在20～22 g，由浙江大学动物实验中心提供，动物合格证号：2007000526749。动物饲养及操作过程均遵守浙江大学《实验动物管理条例》要求。
博莱霉素(Sigma公司，批号：9041-93-4)，复方松及片(京山中医院，批号：20100501)，地塞米松磷酸钠注射液(浙江省仙琚制药股份公司)。
Real time PCR相关试剂[包括dNTP Mixture，Oligo(dt)18 primer，RNase Inhibitor，M-MLV Reverse Transcriptase，宝生物工程(大连)有限公司]，羟脯氨酸测定试剂盒(凯基，KGT030-2)，小鼠TGF-β1 ELISA试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，小鼠β-actin、PDE8A引物(由上海生工生物工程有限公司合成)。
PCR仪(Eppendoff公司)，水平电泳仪(英国CLP公司)。
1.2 模型建立与实验分组
根据本实验室建立的小鼠肺纤维化造模方法，对小鼠进行4%水合氯醛麻醉(280 mg/kg)，然后有创气道给药法滴入生理盐水配制的博莱霉素(2.5 g/L)，剂量为2.5 mg/kg，地塞米松组腹腔注射地塞米松2.0 mg/kg，正常组滴入同等体积的生理盐水。
CFRB提取液配制方法：将片剂粉碎研磨后称重，5倍重量的蒸馏水浸泡过夜，5 000 g离心取上清，然后70℃水浴浓缩至1 g/mL浓度，依次稀释成0.20、0.04 g/mL。灌胃给药剂量分别为低剂量0.4 g/kg、中剂量2.0 g/kg、高剂量10.0 g/kg，博莱霉素气道滴入后即开始给药，博莱霉素给药后14 d处理，半侧肺进行支气管肺泡灌洗及留取另半侧肺组织进行病理学、蛋白及分子生物学检测等 ......
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