唐古特大黄多糖组分1对小肠上皮细胞辐射损伤的保护作用(2)
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参见附件。
1.5 流式细胞仪检测细胞周期
细胞分组及处理同“1.3”项下方法。照射后24 h终止培养，PBS缓冲液冲洗3次，0.25%胰酶消化细胞，1 000 r/min离心5 min，PBS洗涤2次，去上清，收集细胞重悬于预冷的PBS缓冲液中(内含5%胎牛血清)，缓慢加入-20℃预冷的浓度为95%的乙醇，并使终浓度为75%，4℃过夜。上机前PBS离心洗涤2次，调整细胞浓度为5×1010 cells/mL，取适量细胞悬液加入200 μL RNase A酶(浓度1 mg/mL)，37℃孵育30 min，加入100 μg/mL的PI染液使终浓度为20 μg/mL，避光冰浴20 min显色，行流式细胞仪检测。
1.6 统计学方法
采用SPSS 10.0统计软件进行处理，计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示，统计方法使用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 RTP1对IEC-6细胞增殖的影响
6.0 Gy 60Coγ射线照射可显著降低细胞存活率(存活率下降了58%)，照射前预先给予RTP1可剂量依赖性地抑制射线所致的细胞死亡，细胞存活率明显上升，小、中、大剂量组的RTP1细胞存活率分别为56%、65%和83%。见图1。
2.2 RTP1对辐射细胞凋亡的影响
正常活细胞Annexin V、PI均低染；凋亡细胞Annexin V高染、PI低染；坏死细胞Annexin V、PI均高染。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为(FITC-/PI-)；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为(FITC+/PI+)；而右下象限为凋亡细胞，显现(FITC+/PI-)。从流式细胞检测结果可以看到：NC组细胞几乎全部集中在左下象限，表明基本全部为活细胞，与NC组相比，IC组右下象限和右上象限细胞明显增多，凋亡百分率为31.3%，与IC组相比，RTP1组右下象限细胞及右上象限细胞明显减少，凋亡百分率为21.5%，表明照射前给予RTP1可明显抑制细胞凋亡的发生。流式细胞术检测结果见图2。
2.3 RTP1对辐射损伤后IEC-6细胞周期的影响
与NC组比较，IC组G1期细胞数明显增加，S、G2/M期细胞数减少，表现为G1期阻滞，差异具有统计学意义(P < 0.05)；与IC组比较，RTP1中、高剂量处理组G1期细胞显著减少，S期细胞增加，表现为处于DNA合成期的细胞明显增加，差异具有统计学意义(P < 0.05)。见表1。
3 讨论
肠上皮是对放射敏感性很高的再生组织，肠上皮细胞的损伤常常表现为细胞增殖受到抑制，细胞周期进程发生改变，细胞发生凋亡和坏死[6]。Wroblewski等[6]利用X射线照射IEC-6细胞后发现，即使在较小剂量的辐射条件下，IEC-6细胞DNA合成也会受到抑制，并导致细胞生长障碍。细胞周期作为机体生长发育、组织再生和细胞增殖分化的控制中心，对其进行检测是分析细胞增殖动力学的一种快速而准确的方法，辐射引起的细胞周期改变常常表现为G1期阻滞，G2期和S期延迟[7]。
本实验发现，IEC-6细胞受到照射后，细胞增殖受到明显抑制，RTP1预处理可以显著提高细胞的增殖能力，凋亡实验结果亦表明，6.0 Gy 60Coγ射线可显著诱导IEC-6细胞凋亡和坏死，RTP1预处理可明显减少受照射细胞的凋亡和坏死，表明RTP1可通过抑制受照射细胞凋亡而发挥细胞保护作用；细胞周期检测结果表明，60Coγ射线照射后，IC组细胞G1期细胞明显增加，S、G2/M期细胞数减少，表现为G1期阻滞，RTP1预处理可使G1期细胞数显著减少，S期细胞增加，说明处于DNA合成期的细胞数明显增加，以上结果表明，RTP1对辐射损伤的肠上皮细胞具有一定的保护作用，但RTP1通过何种机制发挥该保护作用尚需进一步研究。
[参考文献]
[1] Meineke V， Fliedner TM. Radiation induced multi-organ involvment and failure：challenges for irradiation accident medical management and future research [J]. BJR，2005，27(Suppl)：196-200.
[2] 刘琳娜，刘莉，王志鹏，等.唐古特大黄多糖促进肠上皮细胞的增殖、移行和分化[J].中国药理学通报，2005，21(4)：486-489.
[3] 刘琳娜，张峰，梅其炳，等.唐古特大黄多糖对过氧化氢诱导的肠上皮细胞凋亡的保护作用及其可能机制[J].中国药理学通报，2010，26(7)：877-881.
[4] 刘莉 ......
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