氧化苦参碱减轻大鼠肝纤维化的机制研究(1)
 |
| 第1页 |
参见附件。
[摘要] 目的 探讨氧化苦参碱(oxymatrine，OM)减轻四氯化碳诱导肝纤维化(hepatic fibrosis，HF)的机制。 方法 建立四氯化碳诱导的大鼠HF模型，制备氧化苦参碱脂质体(Oxymatrine liposomes，OM-liposome)、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arginine-Glycin-Aspartic acid，RGD)三肽序列偶联的OM及异硫氰酸荧光素(fluorescent isothiocyanate，FITC)标记的OM-liposome和RGD-OM-liposome。分离HF大鼠的肝脏星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)并体外培养：①将OM-liposome、RGD-OM-liposome和RGD偶联的空白脂质体(RGD-liposome)作用于HSCs，利用透射电镜检测HSCs的细胞亚显微结构(凋亡小体)变化，利用流式细胞技术检测HSCs的细胞周期，利用台盼蓝染色检测HSCs的细胞活性。②将FITC-OM-liposome和FITC-RGD-OM-liposome作用于HSCs，利用荧光显微镜技术比较两种剂型OM在HSCs中的分布。 结果 ①与RGD-liposome比较，OM-liposome可促进HSCs凋亡小体形成，增加HSCs凋亡，降低HSCs的细胞活性；与OM-liposome比较，RGD-OM-liposome可进一步增加HSCs内凋亡小体，促进HSCs凋亡，降低HSCs活性。②RGD可促进OM-liposome在HSCs内的分布。 结论 OM-liposome可在体外诱导HSCs凋亡，RGD可促进OM-liposome在HSCs的分布，进一步促进HSCs的凋亡。诱导HSCs凋亡可能是OM减轻肝纤维化的重要机制。
[关键词] 氧化苦参碱；脂质体；精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸；肝纤维化；肝星状细胞
[中图分类号] R575.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2012)10(c)-0016-03
氧化苦参碱(oxymatrine，OM)是从传统中药豆根槐属植物苦参或豆科植物苦豆子、山根豆中提取的主要活性成分，是一种四环喹嗪啶类生物碱。近年来研究发现，氧化苦参碱对乙型肝炎、丙型肝炎、肝纤维化(hepatic fibrosis，HF)及肝癌都具有较好的疗效[1]，作用机制目前尚不清楚。各种慢性肝损伤均可发展至HF，目前认为HF是对创伤的一个修复过程，在此损伤修复的反应中，细胞外基质(extracellular matrix，ECM)、肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)和细胞因子共同参与发挥了致纤维化的作用[2]。越来越多的研究证实，HSCs的活化、增殖在HF的形成和发展过程中起着重要作用，抑制HSCs的活化及诱导HSCs的凋亡对有效控制肝纤维化起到至关重要的作用。研究证实，OM对其他器官组织损伤、纤维化[3]及肿瘤都有一定的治疗效果，其中，OM抑制细胞凋亡是其减轻胰腺癌的重要机制[4]。因此，笔者猜测OM抑制HSCs活化、诱导HSCs凋亡可能是其治疗HF的重要机制，现将研究报道如下：
1 材料与方法
1.1 实验动物与试剂
清洁级SD大鼠，体质量约200 g(第四军医大学)，大豆卵磷脂(天津远航化学品有限公司)，胆固醇(北京奥博星生物技术责任有限公司)，甲醇(西安化学试剂厂)，氯仿(西安化学试剂厂)，98.9%氧化苦参碱(西安大河药业有限责任公司)，异硫氰酸荧光素(FITC，陕西博微生物试剂公司)，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD) 序列(陕西博微生物试剂公司)，碘化丙啶(PI，陕西博微生物试剂公司)，胶原酶Ⅳ(美国Sigma公司)，密度梯度离心介质Nycodenz(美国Sigma公司)， DMEM培养液(美国Gibco公司)，小牛血清(美国Gibco公司)，胰蛋白酶(美国Gibco公司)。
1.2 方法
1.2.1 制备氧化苦参碱脂质体(逆相蒸发法) 将大豆卵磷脂5.0 g、胆固醇2.5 g，溶于50 mL氯仿-甲醇混合液中，70℃水浴挥干溶剂，加入油酸0.5 g，聚山梨酯2.5 g，搅拌融化。另将氧化苦参碱1.5 g、聚乙烯吡咯烷酮2.5 g溶于pH 7.4磷酸缓冲液中，水浴加热至70℃。将两者混合，恒温搅拌，灌装，密封，超声乳化，所得乳剂在旋转蒸发仪上减压蒸除有机溶剂，然后再进行短时超声，即得乳白色氧化苦参碱脂质体(Oxymatrine liposomes，OM-liposome)。
1.2.2 制备精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸偶联的氧化苦参碱脂质体 按10∶1摩尔比加入RGD，室温震荡过夜，得到RGD修饰的氧化苦参碱脂质体(RGD-OM-liposome)，冰浴下旋涡震荡30 min，通过凝胶柱(CL-4B)，层析法除去未偶连的脂质体。
1.2.3 制备RGD偶联的脂质体 按照“1.2.1”中的方法制备脂质体(不加入氧化苦参碱)，随后按照“1.2.2”中方法将RGD与脂质体偶联。
1.2.4 异硫氰酸荧光素标记药物 用分析天平准确称取所需的FITC，按100∶1比例缓慢加入于RGD-OM-liposome及OM-liposome中 ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(2579kb)。