唐山地区食管癌患者癌组织中HPV16/18感染及p53基因多态性的检(1)
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[摘要] 目的 探讨HPV16/18感染和p53基因多态性与唐山地区食管癌的关系。 方法 收集唐山地区食管癌患者45例，食管良性肿瘤20例，健康对照组20例，采用原位杂交法检测HPV16/18，用PCR-RFLP方法检测p53基因多态性，对照分析其与食管癌发生率的关系。 结果 食管癌组患者、食管良性肿瘤与健康对照组HPV16/18检出率分别为88.9%、5.0%、2.5%，食管癌组患者HPV16/18检出率明显高于其他组(P < 0.05)。p53基因Arg/Arg基因型频率在食管癌组患者、食管良性肿瘤组患者与健康对照组患者中分别为42.2%、35.0%、20.0%，差异有统计学意义(P < 0.05)。在患者癌组织中三种基因型Pro/Pro、Arg/Arg和Pro/Arg构成比在HPV16/18感染组和未感染组差异有统计学意义(P < 0.05)。 结论 唐山地区食管癌高发区可能与高危型HPV16/18的感染有关，个体携带p53 Arg/Arg基因型更容易发生HPV16/18相关的食管癌。
[关键词] 食管癌；p53基因；基因多态性；人乳头状瘤病毒
[中图分类号] R735.1 [文献标识码] C [文章编号] 1673-7210(2012)10(c)-0154-03
食管癌是常见的十大恶性肿瘤之一，其发病率与地理区域、饮食习惯、遗传因素、和病毒感染等有关。其发生、发展涉及多因素、多步骤相互作用的复杂过程，且与多种基因的表达改变紧密相连[1]。故通过了解相关基因如何表达和调控机制，为探查食管癌的病因及治疗提供新的理论基础。近年来具有高致病性的人乳头状瘤病(HPV)16/18与食管癌的相关性备受学者的关注。笔者收集唐山地区食管癌患者资料，探讨HPV16/18感染和p53基因多态性与食管癌的关系。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择2005年5月～2010年11月在迁西县人民医院手术或胃镜活检共85例唐山地区食管疾病患者的新鲜食管组织标本，45例为食管癌患者，其中，男31例，女14例；年龄45～73岁，平均(56.7±5.8)岁；临床分期按照国际食管癌会议制定的标准分期为Ⅰ期25例，Ⅱ期15例，Ⅲ期5例；有淋巴结转移16例，无淋巴结转移29例。另外20例良性肿瘤，20例正常食管组织。所有病例均经术前快速冷冻病理和术后常规病理检查确诊，术前均行未化疗、放疗及免疫治疗。
1.2 方法
1.2.1 HPV16/18的检测 采用原位杂交试剂盒和生物素标记的高危HPV16/18 DNA探针，与蜡块切片做DNA原位杂交。切片于60℃～70℃烘烤60 min脱蜡，置入杂交增强液里，高火加热30 min，冷却后用蒸馏水洗涤，滴加杂交液后盖上盖玻片，置原位PCR仪95℃变性5 min后，转入含30%湿盒增效液的湿盒中，维持37℃过夜，磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡洗片，擦干后滴加内源性过氧化物酶阻断剂，37℃孵育30 min，PBS浸泡洗片，擦干后滴加动物非免疫血清，室温孵育20 min，PBS浸泡洗片，擦干后滴加DAB显色液，室温孵育10 min，PBS浸泡洗片，擦干后苏木素复染。常规封片，镜检。试验阳性对照：已知HPV16/18阳性的食管癌切片。
1.2.2 基因多态性分析 采用PCR-RFLP方法检测p53基因第4外显子72密码子多态性。先行引物设计，引物序列(5'→3')，正向引物CAACACCATAGCAGTAGCAGC，反向引物CAGCCTCTCCTTCATACAGCC，按照试剂盒使用说明书对食管癌患者癌组织及其他标本提取DNA模板，而后行p53基因第四外显子PCR扩增，利用限制性内切酶对PCR扩增产物酶切后用2%的琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像系统中观察结果。
1.3 结果判断
HPV16/18原位杂交阳性信号为棕黄色颗粒，主要定位在细胞核和细胞质内。对肿瘤细胞的观察标准，阳性(+)：细胞核或质内见棕黄色颗粒，阴性(-)：细胞不着色。p53基因不同形态鉴定：仅在413 bp处显示条带的为Pro/Pro基因型，分别在253 bp和160 bp处出现条带的为Arg/Arg基因型，而在413 bp、253 bp、160 bp均有条带出现的为Pro/Arg基因型。
1.4 统计学方法
采用SPSS 13.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 HPVl6/18感染与食管癌患者不同部位组织中的表达情况
食管癌组织、良性肿瘤和正常组织中HPV16/18的感染情况45例食管癌组织中，HPV16/18阳性40例(88.9%)，良性肿瘤中HPV16/18阳性2例(5.0%)，正常组织中HPV阳性1例(2.5%)，食管癌、良性肿瘤和正常组织中HPV16/18阳性率比较差异有统计学意义(P < 0.05)。见表1。
2.2 p53基因多态性在不同标本中的分布
食管癌、食管良性肿瘤和正常患者中三种基因型分布情况如下 ......
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