外源性瘦素对硫代乙酰胺致急性肝损伤保护机制的研究(1)
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[摘要] 目的 探讨外源性瘦素在硫代乙酰胺(Thioactitmide，TAA)所致急性肝损伤早期保护中的作用及可能机制。 方法 36只雄性Wistar大鼠分为正常组、TAA造模组及外源性瘦素预处理组，每组12只。外源性瘦素预处理组于建立急性肝损伤模型前1 h腹腔内注射200 mg/kg外源性瘦素。三组大鼠分别于造模后24 h处死。测定各组小鼠血浆丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平，采用RT-PCR法测定各组小鼠肝组织TNF-α，核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB) mRNA的表达情况。 结果 外源性瘦素预处理组ALT、AST水平较TAA造模组明显降低(P < 0.01)；外源性瘦素预处理组TNF-α水平较TAA造模组明显降低(P < 0.01)；外源性瘦素预处理组TNF-α和NF-κB mRNA表达较TAA造模组明显降低(均P < 0.01)。 结论 外源性瘦素预处理在TAA所致急性肝损伤中可通过抑制肝脏NF-κB活化，进而抑制TNF-α表达，减轻肝损伤，发挥保护作用。
[关键词] 急性肝损伤；硫代乙酰胺；外源性瘦素；保护机制
[中图分类号] R575.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2012)12(b)-0020-02
肝损伤是由各种原因引起的肝脏功能的异常，严重或持续的肝损伤最终导致肝功能衰竭。临床上造成的急性肝损伤原因主要有病毒感染、服药不当、乙醇摄入过量、误服有毒食物等。目前肝损伤的防治在国内外是个严峻的课题。通过建立急性肝损伤动物模型，研究其发生机制，筛选保肝药物及其原理，具有重要的现实意义。最近研究表明，瘦素对胃，小肠、肺、肾、胰腺、心脏等器官的损伤具有保护作用[1]。但在硫代乙酰胺(Thioactitmide，TAA)所致急性肝损伤中作用如何，目前研究较少。本实验旨在探讨外源性瘦素在TAA所致急性肝损伤中的作用及机制。
1 材料及方法
1.1 主要试剂
肿瘤坏死因子α(TNF-α)放射免疫试剂盒购于北京尚柏生物医学技术有限公司。Trizol试剂购自Sigma公司。逆转录试剂盒购自上海生物科技公司。PCR引物基因序列通过GeneBank获得，设计通过Primor 5.0软件完成，上海生物工程公司合成。硫代乙酰胺院国药集团化学试剂有限公司生产。
1.2 动物分组及模型制备
36只雄性Wistar大鼠，体重230～250 g，清洁级，由吉林大学医学实验动物中心提供。大鼠分为正常组、TAA造模组及外源性瘦素预处理组，每组12只。TAA造模组予TAA 200 mg/kg腹腔注射，外源性瘦素预处理组于建立急性肝损伤模型前1 h腹腔内注射瘦素 200 mg/kg，造模步骤同TAA造模组；正常组不造模。予同等剂量0.9%氯化钠溶液腹腔注射。三组大鼠分别于造模后24 h处死。
1.3 血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、血清天门冬氨酸氨基转移酶(AST)和肿瘤坏死因子(TNF)水平检测
血浆标本采用Olympus AU2700生化仪测定ALT和AST浓度，TNF的检测采用放射免疫法。
1.4 核因子-κB(NF-κB)和TNF-αmRNA表达检测
采用RT-PCR法检测NF-κB、TNF-αmRNA表达：提取移植肝组织总RNA，取2 μL用于逆转录，反应体积为50 μL。PCR扩增NF-κB，TNF-αmRNA，以β-actin作为内参照。引物由上海生工生物制品公司合成。NF-κB，TNF-α mRNA和β-actin引物序列分别为：TNF-α上游5'-CCACGCTCTTCTGTCTACTGT-3'，下游3'-GCTACGGGCTTGTCACTC-5'，NF-κB上游5'-CCAGGCGGACATCATCAA-3'，下游 3'-AGGAAAGTAAACCGGAAC-5'，β-actin：上游5'-GAGGGAAATCGTGCGTGAC-3'，下游3'-CTGGAAGGTGGACAGTGAGG-5'。反应条件为： 94℃变性5 min， 94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 45 s，共扩增35个循环，72℃延伸10 min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳观察，凝胶成像系统进行扫描，进行半定量分析，以各基因与相应β-actin的PCR产物积分光密度的比值代表半定量值。
1.5 统计学方法
数据采用统计软件SPSS 13.0进行处理。计量资料采用均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 外源性瘦素对肝功能的影响
外源性瘦素预处理组ALT、AST水平较TAA造模组降低(P < 0 ......
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