EF—hand对钙调磷酸酶B同源蛋白2的生物学功能影响(2)
 |
| 第1页 |
参见附件。
1.8 蛋白质免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，Co-IP)
1.8.1 细胞裂解 收获过表达NHE1的1×107 PS120细胞，用预冷的PBS洗两次，用细胞刮刮下细胞置于1.5 mL离心管里，加入1 mL IP细胞裂解液，之后4 000 r/min离心5 min，吸取上清。
1.8.2 免疫沉淀(IP) 将上述的含蛋白提取物的上清液中加入30 μL的Protein G agarose，同时加入4 μg特异抗体(抗CHP2或NHE1)，4℃轻微摇动1 h，2 000 r/min离心，弃上清，用预冷的IP细胞裂解液洗沉淀3次，加入2×蛋白上样缓冲液，沸水煮3 min，吸上清。
1.8.3 电泳和转膜 将所得到的上清上样，先用SDS-PAGE电泳，再用半干法电转移至硝酸纤维素膜。再用另一种蛋白的抗体杂交，如果能得到特异的带，而阴性对照(IgG)没有带，证明两种蛋白相互结合。
1.8.4 蛋白免疫印记(IB) 分别在室温下用含5%脱脂奶粉的TBST封闭1 h，一抗(抗NHE1或CHP2)孵育1 h，二抗孵育1 h，ECL化学发光法显色，每个样本至少重复3次。
1.9 血清饥饿实验
相同数量的共表达NHE1/野生型CHP2(NHE1/CHP2)或NHE1/CHP2-EF3m/4m的PS120细胞接种于培养瓶内，分别观察在有血清或无血清培养条件下细胞状态及数量变化。
1.10 统计学方法
采用统计软件SPSS 11.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示，以P < 0.05为差异有统计学意义。45Ca2+ 结合平衡采用公式：45Ca2+ =最大45Ca2+ 结合量/(1+Kd-[Ca2+]n)(Kd = Ca2+ 显性解离常数，n = Hill系数)计算。
2 结果
2.1 EF-hand调节CHP2蛋白的构象
经生物信息学方法分析表明CHP2蛋白结构内含有4个可能的EF-hand结构，分别命名为EF1、EF2、EF3、EF4。本研究分别成功构建了CHP2蛋白的4个EF-hand突变体CHP2-EF1m、CHP2-EF2m、CHP2-EF3m、CHP2-EF4m，突变点位于EF-hand的-Z点(图1A)。将大肠杆菌产物表达纯化后得到的CHP2及其突变体蛋白采用SDS-PAGE检测，发现已突变的CHP2-EF3m、CHP2-EF4m在凝胶上的电泳速度减慢，表明突变这两个EF-hand可能使CHP2蛋白构象的发生改变(图1B)。结果提示EF-hand3和EF-hand4对维持CHP2的正常构象发挥重要的作用。
2.2 CHP2结合Ca2+平衡曲线的测定
使用膜截留法测定了EF-hand突变对CHP2钙结合能力的影响。结果显示突变EF-hand3和EF-hand4中任意一个，CHP2结合钙能力下降为正常的1/2；同时突变EF-hand3和EF-hand4，CHP2不能结合Ca2+(图2)。证实CHP2作为一个钙结合蛋白，其Ca2+离子的结合依赖于其分子结构中的EF-hand3和EF-hand4模体结构。
2.3 Ca2+影响CHP2和NHE1蛋白的相互结合
免疫共沉淀实验表明，在Ca2+存在的条件下，NHE1和CHP2能够得到很好的共沉淀，但当利用螯合剂EDTA剥夺细胞内的Ca2+之后，CHP2和NHE1的相互结合减少，表明CHP2结合Ca2+对其与NHE1的结合是至关重要的。见图3。
2.4 EF-hand3和EF-hand4调节CHP2在细胞膜上的定位
通过激光共聚焦显微镜观察GFP标记的蛋白定位，我们可以发现在共转染NHE1的PS120细胞中野生型的CHP2蛋白主要定位在细胞膜上，而EF-hand突变的CHP2蛋白分布在细胞膜的量相对减少(图4)。当EF-hand被突变，CHP2不能与Ca2+结合，CHP2与NHE1的结合能力减弱，观测到其在细胞膜上的定位减少。表明EF-hand是否结合Ca2+能够影响CHP2与NHE1的结合及其在细胞膜上定位。
2.5 不同培养条件共表达NHE1/CHP2或NHE1/CHP2-EF3m/4m的PS120细胞的生长状态观察
在正常有血清培养条件下，共表达NHE1/CHP2或NHE1/CHP2-EF3m/4m的PS120细胞的生长状态无明显差异，但在去除血清即血清饥饿条件下，笔者发现共表达NHE1/CHP2-EF3m/4m的PS120细胞随着培养时间的延长 ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(3874kb)。