EF—hand对钙调磷酸酶B同源蛋白2的生物学功能影响(1)
 |
| 第1页 |
参见附件。
[摘要] 目的 探讨EF-hand结构对钙调磷酸酶B同源蛋白2(CHP2)的生物学功能的影响。 方法 通过PCR扩增CHP2 cDNA片段，构建带GFP标签的野生型及EF-hand突变型CHP2表达质粒；与钠氢离子交换蛋白1(NHE1)共转染PS120细胞；采用激光共聚焦显微镜、膜滤过法、免疫共沉淀等手段，明确CHP2结合Ca2+的数量、部位，以及对CHP2与NHE1结合的影响；在血清饥饿条件下，观察表达EF-hand突变的CHP2(NHE1/CHP2-EF3m/4m)对细胞生存的影响。 结果 分别突变EF-hand结构EF3或EF4，CHP2结合Ca2+减少；同时突变EF3和EF4，CHP2不能结合Ca2+；免疫共沉淀实验结果显示乙二胺四乙酸(EDTA)剥夺CHP2携带的Ca2+之后，CHP2与NHE1结合的数量明显减少；不携带Ca2+的CHP2在细胞内与NHE1结合的数量也明显减少；在血清饥饿条件下，表达不携带Ca2+的CHP2的细胞存活数量减少。 结论 CHP2能结合2个Ca2+，结合部位在EF3和EF4；携带Ca2+能增强CHP2与NHE1的结合能力；在血清饥饿条件下，携带Ca2+的CHP2能提升细胞抵抗死亡的能力。
[关键词] 钙调磷酸酶B同源蛋白2；钠氢交换蛋白1；EF-hand；Ca2+
[中图分类号] Q71 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2012)12(b)-0028-04
钙调磷酸酶B同源蛋白(calcineurin B homologous protein，CHP)是具有多个EF-hand结构的钙离子(Ca2+)结合蛋白。目前报道该家族拥有3个成员，分别被命名为CHP1、CHP2、CHP3[1]。其中CHP1广泛表达于各种组织，CHP3特异性表达在一些正常组织，而CHP2与这两个成员不同，它主要表达在一些肿瘤组织中[2]。最初因发现其在肝癌组织中高表达而命名为肝细胞癌抗原520(hepatocellular carcinoma antigen520，HCA520)[3]，因此被认为是一种肿瘤相关抗原。CHP2已被证明在肿瘤细胞的增殖、转移等方面具有重要作用[4]，目前的研究表明CHP2主要是通过调节钠氢离子交换蛋白1(Na+/H+ exchanger 1，NHE1)活性而发挥功能，通过与NHE1结合而激活NHE1，发挥其调控细胞内离子转运及细胞酸碱的功能[5-6]。但是，CHP2作为一个Ca2+结合蛋白，EF-hand是其分子中结合Ca2+的关键序列，对CHP2发挥正常功能具有重要作用，目前国内尚缺乏EF-hand对CHP2细胞内定位、功能以及与NHE1的相互作用中的影响的报道，本研究将对这些内容进行探讨。
1 材料与方法
1.1 实验试剂及材料
45CaCl2购自美国Dupont-NEN公司。NHE表达缺陷的PS120细胞系、CHP2和NHE1的兔抗人多克隆抗体及野生型人NHE1的真核细胞表达质粒pECE均由日本国立循环系统疾病中心研究所馈赠。E.Coli(BL21-star)、LipofectamineTM 2000 Reagent kit购自美国Invitrogen公司。DMEM 培养基、胎牛血清购自美国GIBCO公司。本实验中所用到的其他质粒均为本实验室保存。
1.2 细胞培养
PS120及相应的转染子按常规方法在(含25 mmol/L NaHCO3、体积分数为10%的小牛血清、50 U/mL青霉素和50 μg/mL链霉素)DMEM培养基中培养于37℃，含5%CO2，饱和湿度的培养箱中。
1.3 CHP2 cDNA的克隆及其表达载体的构建
提取人类血液细胞的总RNA，逆转录成cDNA，采用PCR扩增CHP2的全长cDNA序列，将其在合适的酶切位点克隆进含有绿色荧光蛋白标记基因的载体pEGFP-N1，对此重组质粒命名为CHP2-GFP。同时采用基于PCR突变的方法，将四个EF-hand 的-Z点的氨基酸替换为脂肪族的非极性氨基酸丙氨酸(Ala，A)，这些突变EF-hand的重组质粒分别命名为CHP2-EF1m、CHP2-EF2m、CHP2-EF3m、CHP2-EF4m。
1.4 重组质粒的转染
应用LipofectamineTM 2000将上述重组质粒转染PS120细胞，转染完成24 h后利用G418筛选两周，采用流式细胞仪，根据GFP荧光标记分选得到含有相关重组质粒的单克隆细胞株。
1.5 重组蛋白的制备
将CHP2及其突变体的全长cDNA序列克隆到pET11(重组蛋白末端将带有6个组氨酸的标记)载体中 ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(3874kb)。