少突胶质前体细胞的培养、鉴定及巨噬细胞移动抑制因子对其促增殖作用研究(1)
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[摘要] 目的 少突胶质细胞是中枢神经系统的重要组成部分。本文探讨获取小鼠高纯度少突胶质前体细胞系的培养及鉴定方法，以及巨噬细胞移动抑制因子(MIF)对其增殖活性的调节。 方法 取新生(0～2 d)C57B6小鼠的大脑皮层进行混合胶质细胞培养，在9～10 d时采用振荡、差速贴壁的方法分离、纯化少突胶质前体细胞，然后用添加了神经营养因子(N2)、血小板衍生生长因子-AA(PDGF-AA)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的无血清培养基培养。倒置显微镜下每天观察细胞的生长情况，免疫荧光法对表面抗原进行细胞鉴定。然后按104个细胞/孔加入96孔板培养，细胞70%～80%融合时用不同浓度MIF处理细胞，48 h后用甲基噻唑基四唑(MTT)检测细胞增殖程度。 结果 获得纯度90%以上少突胶质前体细胞(OPCs)，少突胶质前体细胞NG2及血小板衍生生长因子受体(PDGFR)抗体阳性；胶质细丝酸性蛋白(GFAP)及髓鞘碱性蛋白(MBP)均为阴性。MTT检测结果显示低剂量的MIF能促进OPCs的增殖，并具有剂量效应关系；高剂量MIF则抑制OPCs的增殖。 结论 通过振荡及差速贴壁法并结合少突胶质细胞定向培养基可以成功获得高纯度的OPCs，MIF能以剂量效应关系促进OPCs增殖。为进一步深入探讨其相关机制及OPCs移植治疗脊髓损伤奠定基础。
[关键词] 少突胶质细胞前体细胞；细胞培养；巨噬细胞移动抑制因子
[中图分类号] R329.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2012)12(b)-0052-04
少突胶质细胞是中枢神经系统的髓鞘形成细胞，它的主要功能是产生髓鞘包绕神经轴突，维持神经冲动沿轴突跳跃性传导；另外它还分泌多种神经营养因子，支持神经元的生长与存活[1]。少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cells，OPCs)是处于分化早期阶段的未成熟细胞，具有良好的增殖能力，能在体内增殖、迁移，最后分化为成熟少突胶质细胞并为髓鞘形成发挥重要作用。高纯度OPCs的制备、培养是一切研究工作的基础，目前，国内外对大鼠OPCs的培养报道很多，有关小鼠OPCs的培养方法及研究报道还比较少，本文参照国内外文献报道的新生大鼠OPCs的培养方法[2-3]，探索小鼠OPCs的培养及鉴定，并研究重组巨噬细胞移动抑制因子(rMIF)对其增殖活性的影响，为进一步深入研究其发育、分化以及移植治疗脊髓损伤等奠定基础。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
高糖DMEM培养基、胎牛血清为Gibco产品，100×N2添加物为Invitrogen公司产品，PDGF-AA及bFGF为Peprotech公司产品，山羊抗大鼠NG2抗体、兔抗大鼠GFAP及MBP抗体均为BD公司产品，胰蛋白酶为Invitrogen产品，多聚赖氨酸及多聚鸟氨酸为Sigma公司产品，rMIF及拮抗剂ISO-1为Sigma公司产品，MTT试剂盒为Sigma公司产品。倒置相差显微镜(Olympus)、荧光显微镜(Leica)、酶标仪(Thermo labsysytems)。实验动物为清洁级6～8周龄C57B6小鼠，雌雄不限，体质量18～25 g。由第三军医大学第三附属医院(所)实验动物中心提供。
1.2 混合胶质细胞的制备
实验之前，先将D-Hanks液预冷，取5～8 mL于10 cm无菌培养皿里，并将培养皿放于冰上。取新生C57B6小鼠(生后48 h内)，断颈处死后将头埋于冰中1～5 min，然后浸入预冷的75%乙醇中消毒。将断头放入有预冷D-Hanks液的培养皿中清洗酒精，再将断头放入有预冷D-Hanks液的培养皿中，用镊子压住鼻部，沿图1所示的虚线位置依次剪开新生小鼠脑皮肤、颅骨，取出脑组织，在解剖显微镜下用眼科镊依次剥除脑膜及血管，取大脑(剔除海马部分，如图1所示)置于另一个有预冷D-Hanks液的培养皿中(1次可做5～10只新生小鼠)，用眼科剪将组织剪碎，加入0.05%胰酶，用移液枪轻轻吹打几次(所有过程在冰上操作)，充分混匀后，在37℃培养箱内孵育15 min，期间混匀几次，然后加入含血清培养基终止消化。再用70 m细胞筛网过滤细胞悬液，将收集的细胞悬液800 r/min离心5 min，弃上清液，再用D-Hanks液清洗一次细胞，加入完全培养基重悬细胞，并进行细胞计数，然后将混合细胞进行培养。
1.3 混合胶质细胞培养
将上一步制备好的细胞悬液按106/mL密度种植于75 cm2的玻璃培养瓶中，放入5%CO2培养箱中培养1 h，轻轻吸出细胞悬液(以去除已贴壁的成纤维细胞)接种于预先用多聚赖氨酸处理过的75 cm2的一次性细胞培养瓶中，然后将培养瓶放入37℃、5% CO2培育箱培养。第3天半量换液，以后每3天完全换液培养，直到9～10 d。显微镜下观察培养细胞，可见瓶底已被星形胶质细胞铺满，上层可见散在较多的小圆形折光性好的少突胶质前体细胞。
1.4 少突胶质细胞的振荡分离和差速贴壁纯化
第10天时，将培养瓶盖拧紧，用封口膜封口，放于37℃恒温振动摇床150 r/min，震摇1 h，吸出所有培养上清，再加入新鲜培养基以去除小胶质细胞等杂细胞，然后以300 r/min速度振荡18～20 h。吸出细胞悬液加入未经多聚鸟氨酸处理的玻璃培养瓶中，60 min后吸出细胞悬液(此步骤可除去体积较大的星形胶质细胞及成纤维细胞)放入离心管内，800 r/min离心5 min，然后无血清培养液(DMEM-F12，含0.5%胎牛血清、5 mL/L的N2、10 g/L的PDGF-AA、10 g/L的bFGF)重悬细胞，接种于预先用多聚鸟氨酸处理过的培养瓶或培养板中 ......
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