骨桥蛋白基因对大肠癌细胞增殖、侵袭及Akt磷酸化的影响(2)
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参见附件。
1.3.4 荧光实时定量PCR结果分析 上述反应完成后，采用△△Ct法，计算OPN基因相对于GAPDH的△Ct(△Ct =Ct GAPDH-Ct OPN)，以均数±标准差(x±s)表示。
1.4 软琼脂集落形成试验
癌细胞锚着不依赖性增殖采用软琼脂集落形成试验检测，具体试验方法根据文献所述[5]试验进行。
1.5 体外侵袭试验
采用Boyden小室模型方法检测。具体方法参照文献[6]所述方法进行。随机计数10个视野内的细胞数，取平均值进行统计处理，每组计数3份样本。
1.6 癌细胞Akt磷酸化检测
转染48 h后，收集siRNA组和对照组癌细胞，以总Akt(Total-Akt)为内参照，采用常规蛋白质印迹检测各组癌细胞总Akt及磷酸化Akt(p-Akt)蛋白水平。
1.7 统计学方法
采用SPSS 11.5软件对数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示，比较采用t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 siRNA转染对OPN基因表达的影响
为下调OPN基因表达水平，本研究借助于RNA干扰技术，以siRNA转染大肠癌Colo 205细胞后，以荧光实时定量PCR方法迹检测基因mRNA水平。结果显示，与Con-A组细胞比较，不同浓度siRNA组mRNA明显下调(图1)。
2.2 软琼脂集落形成试验
本研究采用软琼脂集落形成试验观察癌细胞锚着不依赖性增殖情况。结果发现，经siRNA转染的细胞集落生长数明显减少，且呈剂量依赖性(P < 0.05)。见图2。
2.3 OPN siRNA转染对大肠癌细胞侵袭的影响
本研究Boyden小室模型方法了解癌细胞侵袭力变化。结果发现，与Con-A组集穿过滤膜胞数比较，不同浓度siRNA组穿膜的细胞数明显减少(P < 0.05)。见图3。
2.4 siRNA转染对大肠癌细胞Akt信号通路的影响
收集转染48 h的细胞，以蛋白质印迹检测Akt磷酸化情况。如图所示，与Con-A组比较，不同浓度siRNA组Akt磷酸化水平下降，且呈浓度依赖性。见图4。
3 讨论
由于RNAi及siRNA具有高效敲除基因表达的作用，已被许多学者用来研究基因功能和基因治疗的重要工具之一。本研究针对OPN基因序列特点，设计合成siRNA，转染处理大肠癌细胞后，采用荧光实时定量PCR检测癌细胞转染效果，结果发现癌细胞OPN mRNA被抑制。说明siRNA具有明显下调OPNmRNA的效果，可以用于作为探讨在大肠癌侵袭作用中的工具。
锚着依赖性(anchorage dependence)指的是细胞须黏附于特定的细胞外基质上才能存活的特性和能力。正常真核细胞，除成熟血细胞外脱离基质将会死亡，而绝大多数肿瘤细胞在脱离基质时亦能存活，即可锚着不依赖性生长。检测锚着不依赖性增殖一般参与软琼脂形成集落培养方法。癌细胞侵袭能力强，则在软琼脂上形成的集落数目多。本课题组发现，经不同浓度的OPN siRNA转染处理后，癌细胞软琼脂形成集落数明显降低，且呈剂量依赖性。体外侵袭试验发现，经OPN基因siRNA转染处理后的大肠癌细胞侵袭细胞数显著降低，且呈浓度依赖性。由此说明，下调OPN基因表达可明显抑制大肠癌细胞的增殖和侵袭能力。
癌细胞侵袭转移过程复杂，PI3K/Akt信号通路的激活引起了广大研究学者的注意。Akt作为PI3K下游最重要的信号分子，由于和蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)和蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)高度同源，也称为蛋白激酶B(PKB)。它是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，约由480多个氨基酸序列构成。目前发现的Akt家族成员有三种亚型：Aktl、Akt2和Akt3，亦称为PKBa、PKBβ、PKBγ，分别由3个不同基因编码[7]。Akt可被许多生长因子如血小板衍生生长因子、表皮生长因子和神经生长因子激活[8]，激活的Akt可以Caspase-9前体蛋白和Bad而使它们失活，从而起到保护细胞作用免于凋亡[9]。许多学者研究发现，Akt信号通路激活，与癌细胞增殖及侵袭能力呈正相关[10-13]。本试验结果显示，OPN基因siRNA转染组Akt磷酸化水平明显下调，且与浓度有关。
本研究提示，抑制大肠癌细胞Akt磷酸化水平，是OPN 基因调控大肠癌细胞增殖、侵袭重要机制之一。
[参考文献] ......
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