二氢青蒿素对膀胱癌T24细胞株的抑制作用及其机制研究(1)
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[摘要] 目的 探讨二氢青蒿素体外抗膀胱癌T24细胞株活性及相关机制。 方法 采用体外培养的T24细胞株为研究对象，流式细胞仪检测二氢青蒿素作用后T24细胞凋亡率，Caspase-3活性检测试剂盒检测Caspase-3活性，免疫印迹法检测细胞凋亡关键蛋白p53、Bax、Caspase-3、Bcl-2的表达变化。 结果 二氢青蒿素能够诱导T24肿瘤细胞凋亡(P < 0.01)，且呈剂量-效应关系；二氢青蒿素还可引发T24肿瘤细胞Caspase-3活性水平升高(P < 0.05或P < 0.01)，促凋亡蛋白Caspase-3、Bax高表达(P < 0.01)，抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低(P < 0.01)，且均呈现时间-效应关系。p53表达水平无显著改变(P > 0.05)。 结论 二氢青蒿素具有明确的抑制膀胱癌T24细胞株的效应，其机制可能是激活非依赖于p53的Bcl-2家族介导的细胞色素C途径，进而引发T24细胞凋亡。
[关键词] 二氢青蒿素；膀胱癌；p53；Bax；Caspase-3；Bcl-2
[中图分类号] R73 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2013)01(c)-0007-03
膀胱癌为尿路上皮系统中多发的恶性肿瘤，且术后较易复发，目前各种预防和治疗药物疗效均不理想或毒副作用较大。青蒿素是一种从植物黄花蒿中提取得到的具有高效抗疟作用的化合物，近期研究证实，青蒿素及其衍生物除了抗疟疾作用外，还可有效抑制肿瘤细胞活性[1-8]。本实验对二氢青蒿素的体外抗肿瘤的效果进行了研究，并深入探讨了相关机制，为其临床抗肿瘤研究奠定实验基础，并为膀胱癌的防治开辟新的途径。
1 材料与方法
1.1 材料
膀胱癌T24细胞株为Foucsbio公司产品。二氢青蒿素半乳糖苷购于中国药品生物制品检定所；胎牛血清、达尔伯克必需基本培养基(DMEM)购于Invitrogen公司，p53、Caspase-3、Bcl-2、Bax和GAPDH一抗为武汉博士德公司生产，辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗小鼠IgG二抗为Promega公司生产，增强化学发光试剂盒(ECL)购于Millipore公司，PI染色试剂盒、Bradford法蛋白定量试剂盒购自北京中杉金桥公司。
1.2 药物处理
细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，4×104个/孔浓度接种于6孔板后继续培养24 h，之后吸弃培养液，用DMEM培养液将二氢青蒿素稀释配成0(对照组)、20、40、80 μmol/L的工作液，加入药物工作液后，细胞继续培养不同时间，进行后续实验。
1.3 流式细胞仪检测凋亡细胞
T24细胞经上述各浓度黄芪皂苷工作液分别处理24、48、72 h后，经0.25% Trypsin-EDTA消化，200 g离心6 min，培养液弃去，磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次，收集的细胞经70%的乙醇4℃固定2 h，14 000 g离心2 min，固定液弃去，PBS缓冲液(含5 mmol/L EDTA)500 μL进行细胞重悬，再经RNA酶室温孵育30 min，PI染液4℃避光条件下孵育30 min，筛网(400目)过滤除去未散开的细胞团块，流式细胞仪检测T24细胞凋亡百分率，每组重复6次，结果取算数均数。
1.4 免疫印迹法检测Caspase-3、p53、Bcl-2及Bax蛋白表达
分别用溶剂(对照组)和40 μmol/L二氢青蒿素(药物组)处理T24细胞，作用24、48、72 h后，免疫印迹法检测Caspase-3、p53、Bcl-2及Bax蛋白表达水平，GAPDH作为内参蛋白，按照如下步骤进行操作：处理后细胞收集，4℃预冷PBS液洗3次，加入细胞匀浆液(50 mmol/L This-HCl pH=7.4，1%Triton X-100，0.2 mmol/L PMSF，1 mmol/L EDTA)，4℃、12 000 r/min条件下离心10 min，吸取上清，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白分离，上样量为10 μL/well，之后将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，封闭，不同浓度稀释一抗Caspase-3(1∶1 000)或p53(1∶500)或Bax(1∶500)或Bcl-2(1∶1 000)或GAPDH(1∶2 500)孵育，4℃过夜，HRP标记抗鼠/兔IgG二抗常温孵育1 h，之后经ECL孵育，暗室内X光胶片成像，GelPro软件进行图像分析，每组重复6次，结果取算数均数。
1.5 Caspase-3活性检测
处理后各组细胞浓集 ......
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