透骨草提取物对人肝癌SMMC—7721细胞Bcl—2和Bax蛋白表达的影响(1)
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[摘要] 目的 观察透骨草提取物对人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的影响，探讨透骨草提取物诱导SMMC-7721细胞凋亡的分子机制。 方法 荧光显微镜观察透骨草提取物对SMMC-7721细胞形态的影响；免疫组化法检测透骨草提取物对SMMC-7721细胞Bcl-2和Bax蛋白表达的影响。 结果 荧光显微镜可见，40.91 μg/mL透骨草提取物处理的SMMC-7721细胞，细胞皱缩，细胞核固缩，呈新月状且边集，呈现凋亡现象。免疫组化结果显示40.91 μg/mL透骨草提取物处理的SMMC-7721细胞Bcl-2蛋白表达明显低于对照组(P < 0.05)，而Bax蛋白表达明显高于对照组(P < 0.05)。 结论 透骨草提取物可能通过下调Bcl-2蛋白表达、上调Bax蛋白表达诱导SMMC-7721细胞凋亡。
[关键词] 透骨草提取物；SMMC-7721细胞；凋亡；Bcl-2；Bax
[中图分类号] R735.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2013)01(c)-0010-03
肝癌发展迅速，恶性程度高，我国每年肝癌患者死亡约13万人，是三大致命癌症之一。因此，防治肝癌是我国医疗卫生事业刻不容缓的任务之一。肝癌的传统治疗疗效均不理想。肿瘤的发生可能与细胞凋亡有关，利用药物诱导肿瘤细胞凋亡称为肿瘤学治疗研究的热点之一。透骨草(Phryma leptostachya L. var. asiatica Hara)具有清热解表、活血消肿的作用[1]。本实验观察透骨草提取物对人肝癌SMMC-7721细胞形态以及Bcl-2和Bax蛋白表达的影响，进一步探讨透骨草提取物诱导SMMC-7721细胞凋亡的分子机制，旨在为透骨草抗肝癌作用的研究和临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 药品、试剂及仪器
透骨草乙醇提取物为大连大学中药研究所提供；人肝癌SMMC-7721细胞购自吉林省肿瘤研究所；鼠抗人Bcl-2抗体和鼠抗人Bax抗体购自Cell Signaling Technology公司，通用型SP试剂盒购自福州迈新生物技术公司；RPMI- 1640培养基购自美国Gibco公司；BB16UV型CO2培养箱为德国Heraeus公司产品；荧光显微镜(CX41)为日本 Olympus公司产品。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养和分组 SMMC-7721细胞培养于10%小牛血清的RPMI-1640培养基中，37℃ 5%CO2培养。胰酶消化传代，选用对数生长期细胞。实验组加入透骨草提取物溶液，终浓度为40.91 μg/mL，对照组加入RPMI-1640培养液，继续培养24 h。
1.2.2 荧光显微镜观察SMMC-7721细胞形态 收集的细胞用PBS缓冲液洗2次，1 000 r/min离心5 min，磷酸盐缓冲液(PBS)调整细胞浓度为1×1010/L。取1×1010/L细胞悬液95 μL，加入0.1 g/L吖啶橙5 μL(吖啶橙终浓度为5 μg/mL)，37℃孵箱中避光染色10 min。滴加染色后的细胞悬液10 μL与载玻片上，封片，荧光显微镜观察细胞形态。
1.2.3 免疫组化法检测SMMC-7721细胞Bcl-2和Bax蛋白表达 按试剂盒说明进行操作。收集实验组和对照组的SMMC-7721细胞，涂片，固定。3%H2O2室温孵育15 min。与正常山羊血清室温孵育15 min。分别与鼠抗人Bcl-2抗体、鼠抗人Bax抗体37℃孵育2 h，PBS洗3次。与生物素标记二抗室温孵育15 min，PBS洗3次。与ABC液室温孵育10 min，PBS洗3次。DAB溶液显色，蒸馏水冲洗，封片，显微镜下观察计数200个细胞，细胞核和细胞浆出现棕色判断为阳性细胞，无棕色染色者为阴性细胞，计算阳性细胞占所有细胞的比例。
1.3 统计学方法
用SPSS 11.5统计软件对免疫组化检测的Bcl-2和Bax蛋白平均光密度进行方差分析，计量资料采用均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 荧光显微镜观察结果
对照组SMMC-7721细胞形态比较规则，胞核较大且染色均匀。实验组SMMC-7721细胞皱缩，细胞核固缩，呈新月状且边集，呈现凋亡现象。见图1。
2.2 免疫组化染色结果
与对照组相比，经40.91 μg/mL透骨草提取物处理后的SMMC-7721细胞，细胞核和浆呈现棕黄色的细胞数量明显减少，Bcl-2蛋白表达明显降低(P < 0.05)，见图2、表1；与对照组相比，经40.91 μg/mL透骨草提取物处理后的SMMC-7721细胞，细胞核和浆呈现棕黄色的细胞数量明显增加，Bax蛋白表达明显增高(P < 0.05) ......
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