蓝莓提取物对人结肠癌细胞的体外抑制作用及机制研究(2)
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参见附件。
1.3 统计学方法
采用SPSS 19.0软件进行数据分析，计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示，比较采用t检验，计数资料采用百分率表示，组间对比采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 蓝莓提取物对HCT116细胞增殖的抑制作用
与对照组(0 mg/L)相比，0.25、0.50、1.00和2.00 mg/L蓝莓提取物处理组的HCT116细胞增殖抑制率明显升高(P < 0.05)；同一浓度的蓝莓提取物分别作用24 h、48 h和72 h后，肿瘤细胞生长抑制率差异有统计学意义(P < 0.05)。蓝莓提取物对HCT116 细胞的增殖抑制作用呈现明显的剂量及时间效应关系，即随着蓝莓提取物剂量和作用时间的增加，其对HCT116 细胞的生长抑制作用逐渐增强(图1)。
2.2 蓝莓提取物对HCT116细胞凋亡的影响
由Annexin V-FITC/PI双参数图(图2A)可见，位于右下象限的为早期凋亡细胞(FITC+，PI-)，位于右上象限的为晚期凋亡细胞(FITC+，PI+)，位于左下象限的为活细胞(FITC-， PI-)，位于左上象限的为坏死细胞(FITC-，PI+)。不同浓度的蓝莓提取物处理24 h即可诱导人结肠癌细胞HCT116发生早期凋亡，随着剂量增加早期凋亡细胞逐渐升高，且晚期凋亡细胞比例也成升高趋势，不同剂量(0、0.25、0.5、1.0、2.0 mg/L)平均凋亡率分别为6.62%、8.86%、16.33%、49.29%、63.68%(图2B)。
2.3 蓝莓提取物对Caspase-3活性的影响
为了深入研究蓝莓提取物抗肿瘤作用的机制，本研究探讨了其对肿瘤细胞Caspase-3的表达及其活性影响。蓝莓提取物对HCT116细胞Caspase-3的表达的影响结果如图3，HCT116细胞在蓝莓提取物作用36 h和72 h后，细胞Caspase-3的活性与对照组相比分别提高2倍和3倍左右(P < 0.01)。
2.4 蓝莓提取物对NF-κB表达的影响
HCT116细胞在药物作用36 h和72 h后，NF-κB表达水平与空白对照组相比分别下降16%和55%左右(P < 0.01)，呈明显的时间效应关系。
3 讨论
近年我国各类癌症发病率日益上升，迫切需要研发出既能抑制癌细胞增殖甚至凋亡而又对人体危害较少的药物，因此开发天然抗癌药物成为研究热点[5-6]。美国农业部(USDA)人类营养中心研究了40种水果和蔬菜，蓝莓所含有的抗氧化活性物质最多(主要成分包括花色苷、黄酮醇等)，研究证明，花色苷比维生素和茶酸等有更强的清除自由基的功能[7-8]。本实验通过观察蓝莓提取物对人结肠癌细胞株HCT116体外生长、增殖、凋亡的影响，探讨了蓝莓提取物对人结肠癌细胞抑制作用以及相关机制。
细胞凋亡是由Caspase家族介导的蛋白酶级联反应过程，不同的细胞或不同信号转导途径诱发的凋亡过程参与的Caspase也不尽相同，而Caspase-3是凋亡的关键酶和执行者，是所有细胞凋亡蛋白酶级联反应的“公共通路”，被称为“死亡蛋白”。研究发现[9-10]，淫羊藿次苷Ⅱ和葫芦素B等植物提取物均可激活Caspase-3并产生级联反应，促进癌细胞凋亡。本研究的结果表明，蓝莓提取物可以引发HCT116肿瘤细胞中凋亡关键蛋白Caspase-3的活性显著升高，且药物作用时间与Caspase-3活性水平之间均呈现明显的时间效应关系。
NF-κB是一种存在广泛且高度保守的核因子，可在基因水平调控癌细胞的增殖、侵袭、血管生成及转移等。NF-κB通路被认为是一个很有前景的癌症治疗靶点[11]。本研究结果显示蓝莓提取物可以显著抑制NF-κB蛋白的表达，并且这种抑制作用具有时间依赖性，提示蓝莓提取物对NF-κB蛋白表达的抑制可能是其机制之一。
综上所述，蓝莓提取物可能通过激活Caspase-3凋亡蛋白酶级联反应通路和抑制癌细胞NF-κB的表达等机制，诱导人结肠癌HCT116细胞凋亡。本研究对于临床应用具有十分重要的指导意义，但是，有关蓝莓提取物抑制人结肠癌细胞生长增殖以及诱导凋亡深入机制，还需进一步研究。
[参考文献]
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[5] 陈正爱，孙庆利，陈莹，等.白藜芦醇抗胃癌作用机制的研究进展[J].延边大学医学学报，2012，35(2)：153-156.
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