复方叶下珠滴丸体外抗乙肝病毒的初步实验研究
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[摘要] 目的 观察复方叶下珠滴丸体外的抗乙肝病毒作用。 方法 将复方叶下珠滴丸试药稀释后，分别加入HepG2.2.15细胞培养液和HBsAg阳性人血清中，于37℃ 5% CO2培养箱孵育后，收取上清液，采用ELISA法及荧光定量PCR法，分析药物对细胞培养上清液和人血清培养液中HBsAg、HBeAg及HBV DNA含量的影响。 结果 复方叶下珠滴丸体外对HBsAg、HBeAg和HBV DNA有不同程度的抑制作用，抑制效果最好浓度为120 mg/mL，时间为72 h。 结论 实验结果证明复方叶下珠滴丸具有明显的体外抗乙肝病毒作用。
[关键词] 复方叶下珠滴丸；体外抗病毒；乙肝病毒
[中图分类号] R512.6+2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2013)02(b)-0015-02
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)的感染会导致急慢性乙型肝炎的发生，是引起肝硬化、肝细胞癌的重要因素之一，每年约有50万人死于由HBV感染引起的急性肝炎、肝硬化及肝癌等疾病[1-2]，目前临床尚无治疗乙肝的特效药物。复方叶下珠滴丸是由叶下珠、半边莲、半枝莲、鸡骨草、茵陈、丹参、柴胡等十六味草药经科学提取工艺精制而成的滴丸，具有疏肝解郁，益气健脾，抗乙肝病毒，改善肝功能、调节免疫机能等功效，能防治急慢性肝炎、重症肝炎、肝硬化、肝癌等疾病。本实验采用酶联免疫吸附检测(ELISA)技术和荧光定量(PCR)方法，分析复方叶下珠滴丸对HepG2.2.15细胞培养液及HBsAg阳性人血清培养液中HBsAg、HBeAg及HBV DNA含量的影响，观察复方叶下珠滴丸体外抗乙肝病毒的作用。
1 仪器与材料
1.1 试药与试剂
试药：采用复方叶下珠滴丸处方中十六味草药以水提醇沉法(加水十倍，煎煮1 h，醇沉浓度为60%)制成的流浸膏(每1 mL含原生药材1 g)为试药。
试剂：HBsAg、HBeAg 诊断试剂盒(新波生物技术公司)，靶细胞选择HepG2.2.15细胞(HBV全基因传染的HepG2细胞)，HBV DNA荧光定量PCR试剂盒(上海复兴生物技术公司)。
1.2 仪器
EFFICUTA2710免疫分析仪和全自动样本前处理系统，Roche Light Cycler480Ⅱ实时荧光定量PCR系统，37℃ 5% CO2培养箱(Phermo)。
1.3 统计学方法
采用SPSS v19.0统计软件进行处理，计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示，比较采用t检验，计数资料采用百分率表示，组间对比采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 方法与结果
2.1 细胞培养
将HepG2.2.15细胞按1×105/mL浓度加入2个24孔培养板中，放入37℃ 5% CO2培养箱培养4 d后换液，将试药稀释，分八组不同浓度药液各滴入4个孔，空白对照组以生理盐水滴入，亦4个孔，加药培养于72 h后各收取1孔细胞上清液， 用 ELISA 测定 HBsAg、HBeAg和PCR检测其HBV DNA含量，并将每组数据与空白对照组进行配对T检验，结果见表1。
根据以上实验，确定复方叶下珠滴丸试药最佳抑制效果浓度为120 mg/mL。为考察其最佳抑制时间，再以120 mg/mL浓度的复方叶下珠滴丸试药，按以上方法培养，加药培养后于24、48、72、96 h后收取1孔细胞上清液再检测其HBsAg、HBeAg和HBV-DNA，48、72、96 h组间数据分别与24 h组进行统计学分析，结果见表2。
2.2 血清培养
将复方叶下珠滴丸试药稀释为120 mg/mL溶液分5组加入HBsAg阳性人血清(HBsAg为2.634 ng/mL，HBeAg为4.799 PEIU/mL，HBV-DNA为650 300 IU/mL)，对照组则加入生理盐水，于37℃孵育72 h，取上清液分别用ELISA 测定各组HBsAg、HBeAg和PCR测定各组HBV-DNA，并作统计学分析，结果见表3。
3 讨论
复方叶下珠滴丸是以叶下珠为主药经科学提取工艺精制而成的滴丸，叶下珠为大戟科植物，有清热利尿、平肝明目、消积解毒、止泻之功效，含鞣质类、黄酮类、香豆素类等多种活性成分[3]，对肝损害具有保护作用，能预防原发性肝癌发生[4]，具有抗肝纤维化、抗乙型肝炎病毒的作用[5]，并对肝癌、胃癌多种肿瘤细胞具有明显的抑制作用[6-7]。辅药中半边莲对肝癌也有明显的抑制作用[8]，半枝莲则可提高机体的抗氧化能力，对肝损伤有保护作用[9]，鸡骨草也有显著的抗乙肝病毒作用[10]。
在HepG2.2.15细胞培养实验中，随着复方叶下珠滴丸试药浓度的增加，对乙肝病毒的抑制作用逐渐增强，呈现一定的剂量依赖性，但其试液浓度为140 mg/mL时对HBsAg、HBeAg抑制作用最强，而其对HBV DNA的抑制作用最强浓度则为120 mg/mL；而其最佳抑制时间的培养试验中，72 h组与96 h组中的HBsAg、HBeAg浓度降低并无差异，HBV DNA抑制作用却与时间呈一定的依赖性；在血清学培养实验结果显示，复方叶下珠滴丸能显著降低HBsAg浓度，具有明显抗HBV的作用。实验结果表明，复方叶下珠滴丸具有明显的抗乙肝病毒作用，今后笔者将做进一步的药效学研究，为临床使用提供实验依据。
[参考文献]
[1] Lim SG，Mohammed R，Yuen MF，et al. Prevention of hepatocellular carcinoma in hepatitis B virus infection [J]. J Gastroenterol Hepatol，2009，24：1352-1357.
[2] Cooke GS ......
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