中药黄芩HPLC指纹图谱的化学轮廓及其影响因素的研究(2)

http://www.100md.com 2013年2月15日 王丹　张秋燕等

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    参见附件。

     结果表明，在274 nm检测下指纹图谱中13号峰峰面积最大，它是黄芩中含量最大的成分黄芩苷的峰；其次还显示了汉黄芩苷(20号峰)、黄芩素(24号峰)、汉黄芩素(26号峰)、千层纸素A苷(19号峰)、千层纸素A(27号峰)、去甲汉黄芩苷(15号峰)等含量较大的黄酮类成分，此外尚含阿替苷(3号峰)等非黄酮类活性成分。这些成分吸收峰明显，且多具有解热、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、保护心血管、降压、抗衰老、神经保护、抑制大鼠前列腺增生等活性[5-8]，故可以在本论文所建立的指纹图谱条件下，利用这些成分对黄芩进行综合的质量控制。

    2.4.2 方法学验证

    专属性试验是以空白溶液(甲醇)10 μL进样，按“2.3”项下方法一色谱条件进行测定，得到图1A中色谱图，说明基线平稳，对样品检测干扰较小。

    在同批黄芩药材(产于河北省丰宁县围场镇，编号：5791，野生黄芩)中平行取样7份，每份重量20～30 g，按“2.2”项下方法制备供试品溶液7份，分别进样10 μL，按“2.3”项下方法一色谱条件进行分析，各主要色谱峰的峰面积的RSD值基本小于5%，表明方法重复性良好。见表4。

    取黄芩药材(河北省隆化县韩麻营镇，编号：5786，栽培黄芩)的同一份供试品溶液连续进样6次，每次10 μL，6次检测结果的主要色谱峰面积的RSD值基本小于5%，保留时间的RSD值小于0.5%，说明仪器精密度良好。见表5。

    在0、3、6、12、24、48、72 h对黄芩药材(编号：200709001)的同一份供试品溶液进行检测，主要色谱峰面积的RSD值基本小于5%，说明样品稳定性良好。见表6。

    2.5 指纹峰的鉴定

    在“2.3.1”项下方法一色谱条件下，利用对照品对黄芩药材中10个成分——黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A苷、千层纸素A、阿替苷、白杨素-6-C-α-L-阿拉伯吡喃糖-8-C-β-D-葡萄吡喃糖苷、5，7，2′，6′-四羟基黄酮、粘毛黄芩素Ⅲ进行了指认和鉴定。并参照参考文献中黄芩成分的MS裂解规律和紫外吸收特征，对黄芩指纹图谱中其余的17个主要色谱峰进行了鉴定。图2A为黄芩提取物在正负离子模式下的总离子流图，图2B为相应的紫外色谱图，测定结果表明所检测的83份黄芩提取物指纹谱中均有1～29号峰，即这29个峰为黄芩的共有峰。其LC-MSn 数据见表7，依照紫外吸收和裂解规律推断未被鉴定的两个化合物7、10应是黄酮类六碳糖苷和六碳糖苷酸。

    2.6 指纹图谱的影响因素

    2.6.1 不同检测波长对黄芩指纹图谱的影响

    对样品编号为6628的药材(产于河北省丰宁县，野生黄芩)供试溶液进行指纹图谱检测，其他条件同“2.3”项下方法一，比较在不同波长(250～350 nm)下总峰数和各主要色谱峰的面积及相对色谱峰面积(以黄芩苷峰面积为100%)、指纹谱总峰面积，发现检测波长对指纹谱有显著影响。

    2.6.1.1 不同波长下检测到的色谱峰数不同，274 nm下可检测到色谱峰数为62个，350 nm下仅能检测到38个色谱峰，14、22、29号色谱峰不能被积分。见表8。

    2.6.1.2 色谱峰面积和相对峰面积在不同波长下差异很大。以1号峰二氢粘毛黄芩素Ⅰ为例，在274 nm处峰面积为521.8 mAU·s、相对峰面积为1.1%，350 nm处其峰面积仅为74.2 mAU·s、相对峰面积为0.8%，而在300 nm处其峰面积为665.0 mAU·S，约是350 nm处的9倍，相对峰面积为2.4%，约是350 nm处的3倍。

    2.6.1.3 与274 nm下的色谱图B相比，A、C、D图的1～8号峰群、9～11号峰群的模式都发生了明显变化，见图3。

    综上，检测波长的变化对指纹图谱化学轮廓的影响是非常显著的。

    2.6.2 不同色谱柱对黄芩指纹图谱的影响

    对1～4号的色谱柱的色谱行为进行考察，其他条件同“2.3”项下色谱方法一，检测黄芩药材样品(产于山西省榆社县，编号：Hq2001004，栽培黄芩)的供试溶液。得到色谱图(图4)，对照紫外光谱，对1～29号化合物进行标示。

    2.6.2.1 使用3号柱、4号柱(方法一所用色谱柱)检测到的指纹图谱轮廓接近，二者图谱中色谱峰出峰种类、出峰顺序一致，除10号峰外，其他1～29号色谱峰均得到分离。

    2.6.2.2 1号色谱柱上化合物的保留时间改变，典型的24、25号色谱峰较3、4号柱保留时间前移，分离度降低，没有分离出21～23号色谱峰，但出峰顺序与3、4号柱一致。

    2.6.2.3 2号色谱柱出峰顺序与1、3、4号色谱柱不同，24号峰出峰在21号峰之前，没有检测到22号色谱峰。

    综上，不同品牌型号色谱柱的分离效果有很大的不同，因而检测到的黄芩指纹图谱化学轮廓很不一致。例如2号柱，它是苯基-己基柱，由于保留特性与C18柱差异较大，故造成了出峰顺序的改变，从而导致指纹图谱化学轮廓的显著改变。

    2.6.3 洗脱梯度对黄芩指纹图谱的影响 ......

    http://www.100md.com/html/paper/1673-0089/2013/05/38-1.htm

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