中药黄芩HPLC指纹图谱的化学轮廓及其影响因素的研究(1)
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[摘要] 目的 建立中药黄芩HPLC指纹图谱方法，研究指纹图谱化学轮廓及其影响因素，为黄芩HPLC指纹图谱方法的推广应用提供参考依据。 方法 采用HPLC指纹图谱分析方法对7个省区83份黄芩(Scutellaria baicalensis根)的化学成分进行测定，考察色谱柱、色谱仪、洗脱梯度、检测波长等因素对指纹图谱的影响，对色谱方法的普适性和耐用性作出系统评价。 结果 用83份黄芩样品建立的黄芩HPLC指纹图谱中有29个共有峰，利用对照品和LC-MS技术对黄芩指纹谱中的27个化合物进行了指认和鉴定；在一定的条件下所建立的指纹谱方法具有良好的精密度、重复性，黄芩供试品溶液在72 h内稳定性良好。在考察各因素中发现，检测波长对指纹谱的化学轮廓影响很大；分别变换色谱仪、色谱柱或洗脱梯度等色谱条件对指纹谱化学轮廓产生的影响亦较大。 结论 所建立的黄芩HPLC指纹图谱方法在一定条件下具有很好的稳定性和实用性，可用于黄芩药材的化学轮廓研究，进而评价黄芩的质量。但是指纹图谱在实际应用中须严格控制规定的测定条件，以确保所得指纹图谱稳定可靠。
[关键词] 黄芩；HPLC指纹图谱；化学轮廓；LC-MS
[中图分类号] R944 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2013)02(b)-0096-07
中药黄芩为唇形科植物贝加尔黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的干燥根[1]，是常用中药材之一。近年来HPLC指纹图谱已被应用于中药黄芩的质量控制评价药材的整体化学特征，LC-MS、NMR技术更提供了丰富的结构信息，使得在化学实验室中进行中药的质量控制更加完善[2-4]。然而在实际的推广和应用中，HPLC指纹图谱检测常受到液相色谱仪、色谱柱、检测波长、流动相、洗脱梯度等条件的影响，色谱方法的普适性和耐用性直接决定其实际的应用价值。本文利用建立的中药黄芩的HPLC指纹图谱方法，系统考察改变部分色谱条件(不同仪器、色谱柱、柱温、流动相的洗脱梯度等)对黄芩提取物指纹图谱的影响，找出主要的影响因素，并对指纹图谱方法的普适性和耐用性作出了明确的评价。本研究可为黄芩指纹图谱的质量控制和方法推广提供科学依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器及色谱柱
仪器：Agilent 1100型高效液相色谱仪，配有G1312A二元泵、G1315D DAD检测器，Agilent化学工作站；Waters 2690-996液相色谱仪配有2690系列四元泵、996紫外二极管阵列检测器、Millennium32工作站。LC-MS-IT-TOF液质联用仪(Shimadzu，Japan)，配有ESI源、二极管阵列检测器、自动进样器、LCMS solution 3.50工作站；分子式预测软件(Shimadzu，Japan)。
4种色谱柱：1～4号色谱柱见表1。
1.2 试剂
甲醇(Fisher公司，色谱纯)，无水甲酸(分析纯，天津光复精细化工研究所)，双蒸水(娃哈哈饮用纯净水，杭州娃哈哈集团)。对照品：黄芩苷、汉黄芩苷、千层纸素A苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A、阿替苷、白杨素-6-C-α-L-阿拉伯吡喃糖-8-C-β-D-葡萄吡喃糖苷、5，7，2′，6′-4OH黄酮、粘毛黄芩素Ⅲ，是由天然药物学实验室制备，经纯度鉴定，均达到98%以上，符合要求。
1.3 药材
本实验检测药材共计83份，其中21份产自甘肃，10份产自山东，17份产自河北，12份产自陕西，13份产自山西，8份产自内蒙古，2份产自黑龙江，全部药材经北京大学药学院生药学研究室蔡少青教授鉴定为唇形科黄芩属植物贝加尔黄芩的干燥根，凭证标本存放于北京大学药学院生药标本室。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液制备
将对照品适量溶解在70%甲醇溶液中，超声至完全溶解，过0.45 μm微孔滤膜，即得。
2.2 样品制备
去粗皮，茎残基及根茎，主根剪成1～2 cm的短节，粉碎并过40目筛，在55℃下干燥2 h，迅速精密称定0.5 g，置入具塞锥形瓶中，加入70%甲醇50.00 mL，室温超声提取30 min，稍静置至澄清，上清液用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。
2.3 色谱和质谱条件
2.3.1 方法一
色谱条件：Agilent 1200液相色谱仪，色谱分析柱为Phenomenex Gemini C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为A相1%甲酸水溶液，B相为甲醇，流速为1 mL/min，检测波长为274 nm，进样量为10 μL，柱温为30℃。梯度洗脱见表2。
2.3.2 方法二 ......
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