大孔树脂纯化五味子总木脂素、总三萜工艺研究(2)
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参见附件。
由表1结果可知，与其他类型的树脂相比，AB-8型树脂对总木脂素、总三萜、五味子醇甲的吸附解析性能最好，故选择AB-8大孔树脂进行进一步的实验。
2.4 AB-8型大孔树脂吸附解析工艺条件优化
2.4.1 上样液浓度的影响
称取10 g AB-8型大孔树脂湿法装入色谱柱(树脂柱床体积约10 mL)，分别制备浓度为0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL(以总木脂素的含量计，均为175.00 mg)的五味子上样液，以1BV/h的流速通过树脂柱进行吸附，收集流出液，水浴蒸干后测定总木脂素、总三萜的含量，计算比吸附量，结果见图1。
由图1结果可知当上样液浓度为1.5 mg/mL时，AB-8大孔吸附树脂对总木脂素的比吸附量最大，为11.79 mg/g；当上样液浓度分别为0.5、1.5 mg/mL时，对总三萜比吸附量最大，分别为7.97、7.44 mg/g。以树脂对总木脂素的吸附解析性能为主要考察指标，兼顾总三萜的吸附解析率，最终确定1.5 mg/mL为最佳上样液浓度。
2.4.2 最大上样量的考察
将110 mL五味子上样液(总木脂素浓度为1.5 mg/mL)，以1BV/h的流速通过AB-8大孔树脂柱(10.0 g)进行吸附，分段收集流出液，每10毫升一份，共接取11份，水浴蒸干测定其有效物质的含量。以流出液体积为横坐标，流出液中有效物质浓度为纵坐标，绘制泄露曲线见图2。
由图2泄漏曲线可知，上柱流出液达到7BV时，流出液中总木脂素浓度约为上样液浓度(1.5 mg/mL)的10%，说明总木脂素开始泄漏，上柱液为4BV时，总三萜开始泄漏；以总木脂素为主要考察指标，最终确定最大上样量为70 mL。
2.4.3 水洗量的考察[10]
由于蒸馏水对木脂素和三萜的洗脱能力很弱，用蒸馏水洗涤可除去糖类等水溶性杂质。配制70 mL五味子上样液(总木脂素浓度为1.5 mg/mL)，以1BV/h的流速通过AB-8大孔树脂柱(10.0 g)，然后用蒸馏水以1BV/h的流速进行洗脱，分段收集过柱流出液，每10 毫升收集1份共15份。用Molish反应检测糖的反应是否为阴性，9BV时Molish反应为阴性，故确定蒸馏水的体积为9BV。
2.4.4 洗脱溶剂体积分数的考察[11]
配制70 mL五味子上样液(总木脂素浓度为1.5 mg/mL)，以1BV/h的流速通过AB-8大孔树脂柱(10.0 g)，吸附完全后，用90 mL蒸馏水以1BV/h的流速进行洗脱，然后分别用10BV的体积分数分别为10%、20%、30%、50%、70%、80%、90%、95%的乙醇连续洗脱，洗脱流速为1BV/h，测定各个梯度洗脱液有效物质的含量，结果见图3、4。
由图3、4结果可知用10%、20%、30%等低浓度乙醇洗脱所得组份中总木脂素和总三萜的质量分数较低，由90%，95%等高浓度乙醇洗脱所得组份中总木脂素和总三萜的质量分数也较低。综合考虑终产品中总木脂素和总三萜的含量和质量分数，首先采用30%乙醇洗脱除去杂质含量高组份，然后用80%乙醇洗脱得到有效物质含量高的组分。
2.4.5 洗脱溶剂用量的确定
将70 mL五味子上样液 (总木脂素浓度为1.5 mg/mL)，以1BV/h的流速进行上柱，通过AB-8大孔树脂柱(10.0 g)，90 mL蒸馏水以1BV/h的流速洗脱树脂柱，30%乙醇洗脱树脂柱，流速为1BV/h，分段收集洗脱液，每10毫升收集1份，共10份；然后用80%乙醇洗脱树脂柱，流速为1BV/h，分段收集洗脱液，每10毫升收集1份，共12份，水浴蒸干流出液，测定其总木脂素和总三萜的含量，结果见图5、6。
由图5结果表明当30%乙醇洗脱用量为9BV时，累积固形物的质量已达到总流出液固形物质量的99%；图6结果表明当80%乙醇洗脱用量为10BV时，可将98%以上的有效物质含量高的组分洗脱下来，综合考虑有效物质的洗脱率、洗脱溶剂用量、洗脱时间等因素，最终选择30%乙醇洗脱用量为9BV，80%乙醇洗脱用量为100 mL。
2.5 验证试验
按照上述确定的纯化五味子总木脂素总三萜的工艺制备3批样品，测定其中总木脂素、总三萜、五味子醇甲的含量。3批样品中总木脂素含量分别为39.67%、39.59%、39.36%，平均值为39.55%；总三萜的含量分别为14.09%、13.84%、13.94%，平均值为13.96%；五味子醇甲含量分别为9.05%、8.89%、8.92%，平均值为8.95%；三者含量均显著提高，分别提高了6.8、3.7、11.9倍。经过一系列考察可知应用大孔树脂纯化五味子总木脂总三萜的工艺合理、可行，重现性较好。
3 讨论
应用大孔树脂同时纯化五味子总木脂素和总三萜的研究未见报道。本文通过对5种不同类型的大孔树脂吸附解析性能考察，发现AB-8型大孔树脂最适合五味子总木脂素总三萜的精制纯化。通过动态吸附解析实验对各个工艺参数进行考察，最终确定AB-8型树脂最佳工艺条件。
本文首次采用梯度洗脱法同时纯化五味子总木脂素总三萜，首先用低浓度乙醇洗脱树脂柱以除去杂质含量高的组分，然后用高浓度乙醇洗脱树脂柱以获得有效物质含量高的组分。经过纯化后终产品中有效物质的含量显著提高，总木脂素质量分数由5.80%提高到39.55%，总三萜的质量分数由3.76%提高到13.96%，五味子醇甲质量分数由0.75%提高到8.95%，分别提高了6.8、3.7、11.9倍。
目前应用大孔树脂分离纯化五味子所得的终产品中有效物质的含量较低，因此患者服药量较大，并且过多的非有效成分可能会产生毒副作用。本文采用梯度洗脱法同时纯化五味子总木脂素和总三萜，为高纯度五味子有效组分的生产提供了理论依据，对传统中药五味子的开发利用具有重要意义。
[参考文献]
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[4] 干正洋，杨庆雄，黄小燕.南五味子属植物中三萜类成分及其活性研究进展[J] ......
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