丝瓜籽核糖体失活蛋白基因Luffin—a原核表达载体的构建(2)
2 结果
2.1 丝瓜Luffin-a基因片段的PCR扩增
Trizol常规提取未成熟丝瓜种子总RNA，紫外分光光度仪检测RNA样品A260/A280值为1.83，说明样品纯度好。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后在凝胶成像系统中拍照取图，在760 bp处有一条强荧光条带，其大小与预期片段大小一致。
2.2 Luffin-a基因重组表达质粒的鉴定
PCR产物切胶回收，与T载体连接，连接产物转化感受态细胞TOP10，通过蓝白斑筛选，提取重组的克隆载体，采用菌落PCR和双酶切鉴定，再用1%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR扩增产物和原核表达载体PET-15b(+)分别进行NdeⅠ、BamHⅠ双酶切，T4DNA连接酶定向连接，16℃反应过夜；重组质粒pET-15b(+)-Luffin-a转化BL21(DE3)pLys感受态细胞，涂LB(ampr)平板，挑取单克隆菌划线培养 ......
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2.1 丝瓜Luffin-a基因片段的PCR扩增
Trizol常规提取未成熟丝瓜种子总RNA，紫外分光光度仪检测RNA样品A260/A280值为1.83，说明样品纯度好。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后在凝胶成像系统中拍照取图，在760 bp处有一条强荧光条带，其大小与预期片段大小一致。
2.2 Luffin-a基因重组表达质粒的鉴定
PCR产物切胶回收，与T载体连接，连接产物转化感受态细胞TOP10，通过蓝白斑筛选，提取重组的克隆载体，采用菌落PCR和双酶切鉴定，再用1%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR扩增产物和原核表达载体PET-15b(+)分别进行NdeⅠ、BamHⅠ双酶切，T4DNA连接酶定向连接，16℃反应过夜；重组质粒pET-15b(+)-Luffin-a转化BL21(DE3)pLys感受态细胞，涂LB(ampr)平板，挑取单克隆菌划线培养 ......
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